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LFY是花分生组织特性基因(floral meristem identity gene),广泛表达于植物的营养器官和生殖器官。LFY与调控植物开花时间的基因密切相关,调控开花时间的四条途径均表达于LFY基因的上游且在LFY基因处整合,LFY在花诱导后表达水平加强。通过对模式植物拟南芥LFY基因研究的深入,发现LFY基因是一个控制花序梢分生组织特征的基因,LFY参与促进花分生组织的形成和花分生组织属性的控制,参与维持花分生组织的正常功能、花启动、防止花分生组织的逆转。在花分生组织属性基因中LFY基因是首先表达的。LFY编码了一个发育开关,其活性足以将所有侧梢转变成单花芽,从而诱导植株提早开花。植物LFY基因表达量只有达到一定值时才能成花,同时其过量表达不影响花模式且能提前成花。生物技术的迅速发展启发人们用转基因的手段研究应用LFY基因,在转LFY基因杨树、烟草、菊花和水稻等植物中,LFY的超量表达均使花期提前。本实验在吸取前人经验的基础上,构建了适合植物的表达载体pRI101-LFY,并将其转化进入根癌农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法将LFY基因转入蝴蝶兰中,然后对转基因植株进行检测,借以初步探讨LFY基因在蝴蝶兰中的转化和表达情况,使LFY基因能够超量表达,从而获得能提前开花的蝴蝶兰品种。实验结果如下:(1)蝴蝶兰LFY基因的获取及克隆根据ncbi中已报道的蝴蝶兰LFY基因序列,运用RT-PCR法扩增出LFY基因,连接至克隆载体pMD19-T后转化E.coli DH5α,通过质粒PCR、双酶切、测序鉴定,得到重组质粒pMD19-T-LFY。(2)蝴蝶兰LFY基因植物表达载体pRI101-LFY的构建与鉴定利用DNA重组技术,将蝴蝶兰LFY基因克隆至植物表达载体pRI101中后转化E.coli DH5α,通过质粒PCR、双酶切、电泳鉴定证明蝴蝶兰LFY基因植物表达质粒pRI101-LFY成功构建。(3)pRI101-LFY质粒转化根癌农杆菌将重组质粒pRI101-LFY通过直接转化法导入根癌农杆菌EHA105中,用利福平(Rif)和卡那霉素(Kana)进行筛选得到阳性克隆,通过质粒PCR,双酶切鉴定证明重组质粒成功转化根癌农杆菌EHA105。(4)蝴蝶兰再生体系的建立采用无菌蝴蝶兰原球茎为外植体,以MS为基本培养基,筛选出播种培养基:1/4 MS+KT 0.5mg/l+AC 1g/l+蛋白胨1g/l+椰汁50%,成苗培养基:1/2 MS+NAA 5mg/l + IBA 5m g/l+AC 0.5%+土豆50g/l,分化培养基:1/2 MS +6-BA 10mg/L+椰汁20g/l,生根培养基:1/2 MS + 6-BA 0.3mg/l。(5)转化体筛选及植株再生将预培养3-4天的原球茎与农杆菌菌液浸染5-15分钟后,共培养2-3天,然后转化到含MLPN和Kana的选择培养基上进行分化筛选,转入外源基因的原球茎将会在这一系列筛选过程中发芽、生根,获得转基因植株。(6)转基因蝴蝶兰植株的PCR检测提取转基因蝴蝶兰植株基因组DNA后,PCR扩增蝴蝶兰LFY基因,证明LFY基因已导入蝴蝶兰中,转化率为25%。