研究背景心脏瓣膜疾病是一类由各种原因引起的瓣膜结构破坏和功能失调并严重危害人类健康的疾病，人工心脏瓣膜置换是其主要治疗方法，全世界每年逾45万例患者接受换瓣治疗。目前临床上使用的人工心脏瓣膜主要分为两类：机械瓣膜和生物瓣膜。虽然它们都能部分替代原有瓣膜的功能从而改善患者生活质量并延长患者生命，但是由于其自身材料和结构等缺陷难以完美替代自身瓣膜并存在多种并发症和后遗症。机械瓣膜置换后需要终生抗凝，因抗凝不当易引起出血、血栓和栓塞；生物瓣膜的血流动力学性能好，但因钙化和衰坏易导致生物瓣功能障碍，需要10到15年后再次进行瓣膜置换。因此研制有生长和修复能力的组织工程心脏瓣膜（TEHV）已成为心脏瓣膜研制的主要方向。然而，目前研制的TEHV体内移植后均无法适应体内复杂的力学环境，不能耐受高压、高速血流的冲击。生物力学信号是心脏瓣膜生长发育过程中一种重要的细胞外调控信号，使瓣膜细胞随着发育逐步适应高压高速的血流力学环境。如何系统模拟瓣膜生理发育过程中逐渐增高的压力和血流速度变化等力学信号调控过程，在TEHV体外构建的过程中从种子细胞培养分化开始就进行仿生性力学渐进性系统训练、调控，逐步增强种子细胞适应高压、高速血流冲击的能力，对研究TEHV及其它须面对体内复杂应力环境的组织工程器官具有重大意义。研究目的本课题研究渐进性力学适应对MSCs活性、功能和分化等的影响及相关机制，寻找细胞内力学信号作用的关键分子，为基因改造优化种子细胞提供理论基础，探索可显著改善MSCs耐受高压、高速血流冲击的仿生性力学训练系统方案。研究方法和结果第一部分渐进性力学适应对MSCs活性功能的影响培养的大鼠MSCs分为6个实验组分别接受0、5、10和15dyn/cm2剪应力及渐进性增加剪应力0~10和0~15dyn/cm2处理。Brdu法检测细胞增殖，划痕实验检测细胞迁移，Elisa检测细胞分泌，贴壁率检测细胞粘附及Tunel检测细胞凋亡。结果：与静态培养的MSCs相比，高恒定剪应力（15dyn/cm2）提高细胞增殖率、迁移率和粘附率(P值均<0.05)，同时显著提高MSCs分泌VEGF、TGF-β1、bFGF和PDGF细胞因子水平(P值均<0.01)。与单纯高剪应力（15dyn/cm2）干预的MSCs相比，0~15dyn/cm2渐进性力学适应提高细胞增殖率、迁移率和粘附率(P值均<0.05)，同时提高MSCs分泌VEGF、TGF-β1、bFGF和PDGF细胞因子水平(P值均<0.05)。单纯高剪应力（15dyn/cm2）干预的MSCs相比静态培养的MSCs细胞凋亡率显著提高(P<0.01)，而0~15dyn/cm2渐进性力学适应可以显著减少细胞凋亡(P<0.01)。第二部分渐进性力学适应增强MSCs活性机制研究Western-blot检测PIM-1等目的蛋白表达，采用siRNA和蛋白抑制剂探索相关分子机制，transwell研究细胞分泌变化对细胞迁移的影响。结果：0~15dyn/cm2渐进性力学适应提高PIM-1蛋白表达以及Akt、p38和ERK蛋白磷酸化水平(P值均<0.05)，加入Akt、p38和ERK蛋白抑制剂后，研究发现p38和ERK蛋白被抑制时PIM-1蛋白表达水平下降(P<0.01)，通过siRNA抑制PIM-1基因发现渐进性力学适应后MSCs增殖率下降(P<0.01)。Transwell结果显示0~15dyn/cm2渐进性力学适应显著提高MSCs迁移率(P<0.05)，提示MSCs细胞分泌水平提高可能促进了细胞迁移。0~15dyn/cm2渐进性力学干预后，MSCs中纤连蛋白(FN)和玻璃粘连蛋白(VN)的表达增加(P<0.05)，提示渐进性力学适应可能通过增加这两种粘附蛋白的表达促进MSCs粘附能力提升。第三部分渐进性力学适应对衰老MSCs活性功能影响取4周龄SD大鼠和24月龄SD大鼠MSCs，研究衰老对MSCs生长状态以及耐受剪应力的影响。给予抗氧化剂干预后，记录细胞群体倍增数，检测细胞内活性氧自由基(ROS)、8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）和蛋白质金属羰基合物（protein carbonyls）水平，并通过real time PCR检测p16和p53基因表达。对不同组MSCs分别施加渐进性力学适应，观察细胞增殖、迁移、分泌、粘附和凋亡的情况。结果：与4周龄SD大鼠来源MSCs相比，24月龄SD大鼠来源MSCs群体倍增数（PD）明显下降(P<0.01)，细胞内氧化应激水平显著升高(P<0.05)，p16和p53基因表达增加(P<0.05)。在使用抗氧化剂干预后，细胞内氧化应激强度下降(P<0.05)，p16和p53基因表达水平下降(P<0.05)，群体倍增数增加(P<0.05)。24月龄SD大鼠来源MSCs在接受渐进性力学适应后，MSCs活性功能未明显提高，凋亡增加(P<0.05)；给予抗氧化剂干预后，渐进性力学适应提高衰老MSCs活性功能及减少凋亡(P<0.05)。第四部分渐进性力学适应诱导细胞分化及其机制研究渐进性力学适应诱导MSCs向平滑肌样细胞方向分化，免疫荧光染色法观察诱导分化后细胞是否表达平滑肌样细胞特异性标志物平滑肌肌动蛋白（SMA）和钙调蛋白（Calponin），real time PCR分析SMA和Calponin基因表达，通过特异性蛋白抑制剂探索相关机制。结果：SMA和Calponin免疫荧光染色阳性，提示渐进性力学适应诱导MSCs向平滑肌样细胞方向分化。Real time PCR结果显示渐进性力学处理后SMA和Calponin基因表达显著增加(P<0.01)，渐进性力和TGF-β1处理提高这两种基因表达(P<0.01)。PD98059（ERK阻断剂）抑制MSCs向平滑肌样细胞方向分化(P<0.05)，提示ERK分子信号通路在调控细胞分化过程中发挥重要作用。第五部分渐进性力学适应MSCs种植后在体研究将渐进性力学适应后MSCs和未经力学适应MSCs分别种植于脱细胞猪主动脉壁上。采用仿生脉动生物反应器模拟体内力学环境处理血管后，分光光度法检测DNA含量，western blot检测I型胶原含量。将MSCs种植于脱细胞带瓣管道上并移植于犬腹主动脉，1月后行B超观察，并取组织标本行大体观察、HE染色、DNA和胶原含量测定。结果：在体外模拟实验中，渐进性力学适应后的MSCs在主动脉壁上存留较多，DNA含量明显高于对照组(P<0.01)，Western blot结果显示渐进性力学适应后MSCs的I型胶原含量明显高于静态培养组(P<0.01)。体内实验发现两种移植物均无血栓形成，力学适应后MSCs在移植物上存留较多，DNA含量明显高于对照组(P<0.01)，分泌胶原含量也显著高于静态培养组(P<0.01)。说明力学适应后MSCs接种于支架材料后可较好耐受高速、高压流体力的冲击。结论1.本研究系统探索了恒定剪应力和渐进性增加剪应力对培养MSCs的作用，发现随着0、5、10和15dyn/cm2剪应力强度逐渐增加， MSCs的增殖、迁移、分泌和粘附能力经过力学训练后得到提高，0~15dyn/cm2渐进性力学适应可以进一步提高细胞增殖、迁移、分泌和粘附能力，同时0~15dyn/cm2渐进性力学适应相比于同等强度下的高恒定剪应力可以减少细胞凋亡。2.研究证实0~15dyn/cm2渐进性力学适应可激活p38和ERK信号通路调控的PIM-1蛋白表达从而促进MSCs增殖，提高了MSCs的自分泌能力使其迁移能力增强，并且促进FN和VN蛋白表达使MSCs粘附能力提高，初步阐明了渐进性力学适应提高MSCs活性功能的机制。3.研究发现老年大鼠来源MSCs比青年大鼠来源MSCs氧化应激水平升高、DNA和蛋白质损伤加重以及活性功能下降。在接受0~15dyn/cm2渐进性力学适应后，老年大鼠来源MSCs活性功能未见显著提高，凋亡率也明显上升。给予抗氧化剂干预后，0~15dyn/cm2渐进性力学适应提高老年大鼠来源MSCs活性功能并减少凋亡。4.0~15dyn/cm2渐进性力学适应可以在体外培养时诱导MSCs向平滑肌样细胞方向分化，这种诱导能力在结合TGF-β1后得到进一步增强，ERK信号通路可能参与调控了诱导分化过程。5.经过体内和体外模拟机体周期搏动性血流研究后发现，0~15dyn/cm2渐进性力学适应后的MSCs可以更好的附着和存活于支架材料上，能够分泌胶原蛋白，在此基础上可以更好的发挥组织重塑功能。