造血微环境(hematopoietic inductive microenvironment,HIM)是造血干/祖细胞定殖、分化、发育和成熟的场所。基质细胞作为造血微环境中的重要成分,不仅与造血细胞的自我更新、增殖分化、归巢定位以及在血液系统疾病的发生发展和转归过程中密切相关,在免疫调节中也具有重要的作用。因此,深入探讨基质细胞对造血及免疫的影响,对血液学的研究和发展十分重要。异基因造血干细胞移植是目前治疗血液肿瘤的有效手段之一,但仅有30%的患者能够找到全相合的供者。HLA半相合造血干细胞移植可使90%的患者找到相合的供者,但HLA半相合造血干细胞移植面临植入失败率高、造血重建慢、GVHD重、免疫重建迟、致死性感染发生率发生高、移植相关死亡率高等诸多障碍。因此,调控GVHD,达到降低HLA半相合造血干细胞移植相关死亡率和提高患者的生存率,是目前临床工作亟待解决的问题。本科室在前期工作中证实,脐血中存在基质细胞前体细胞,并能通过特定的细胞因子组合使人脐血源基质细胞(human umbilical cord blood- derived stromal cells, hUCBDSCs)得以有效扩增;扩增后的hUCBDSCs具有支持造血干/祖细胞扩增的作用。研究hUCBDSCs的免疫调节作用是一个新的探索课题。基于上述分析,本课题首先对hUCBDSCs原代培养MNCs的分离条件进行优化,同时体外探讨hUCBDSCs对小鼠GVHD调节作用,并进一步对hUCBDSCs在HLA半相合造血干细胞移植小鼠的造血重建及GVHD调节作用进行初步的探讨。一、本研究的主要内容和研究方法1.采用6%明胶联合Percoll两步分离法,改良Dexter基质细胞培养体系行hUCBDSCs培养,采用倒置显微镜观察不同分离方法培养的hUCBDSCs生长状况,瑞士染色观察细胞形态,细胞化学和免疫细胞化学进行细胞鉴定;CCK-8检测hUCBDSCs的增殖;2.体外进行混合细胞培养,采用CCK-8检测hUCBDSCs对小鼠脾脏淋巴细胞的增殖作用;采用流式细胞仪技术检测淋巴细胞细胞周期的变化;采用流式细胞仪术、荧光免疫细胞化学检测混合细胞培养中CD49b NK细胞、CD3 T细胞及CD49d粘附分子的表达变化,ELISA检测混合细胞培养上清中IL-4和IFN-γ细胞因子表达变化;采用扫描电子显微镜及荧光免疫组织化学进一步研究混合细胞培养中淋巴细胞粘附hUCBDSCs情况,初步探讨hUCBDSCs在体外对小鼠脾脏淋巴细胞的免疫调节作用,并以人骨髓基质细胞(hBMSCs)作为对照;3.以亲代C57BL/6 (H-2d♀)小鼠作为供体鼠,BABL/C (H-2b♂)×C57BL/6 (H-2d♀)的F1代(H-2b×d )为受体鼠,60COγ射线全身照射后,受体鼠接受供体鼠来源的骨髓细胞1×107个/只及脾细胞1×107个/只,进行HLA半相合造血干细胞移植,观察移植后小鼠存活期、嵌合率、GVHD临床表现和病理变化,构建HLA半相合造血干细胞移植小鼠GVHD模型;4.将体外培养的1×106个/只hUCBDSCs输入HLA半相合造血干细胞移植小鼠体内,观察hUCBDSCs对小鼠造血重建及CFU-F、CFU-GM、CFU-E、CFU-Mg形成能力的影响;5.在构建的GVHD模型基础上,加入1×106个/只hUCBDSCs,观察GVHD的发生情况;采用流式细胞仪术检测移植后受体小鼠脾脏不同时项点CD49b NK细胞、CD3 T细胞及CD49d粘附分子的表达,ELISA检测受体小鼠外周血上清中不同时项点IL-4和IFN-γ细胞因子的表达,荧光免疫组织化学检测受体小鼠GVHD靶器官粘附分子CD49d的表达;6.观察CM-DiI标记的hUCBDSCs在HLA半相合造血干细胞移植受体小鼠体内的迁移分布情况。二、实验结果1. hUCBDSCs原代培养MNCs分离条件的优化:采用6%明胶对脐血红细胞的沉降效果明显优于3%的明胶;6%明胶联合Percoll分离法在MNCs和CD34+细胞的回收率上明显优于3%明胶联合Ficoll分离(p<0.05);6%明胶联合Percoll分离法培养的hUCBDSCs在细胞增殖、48 h细胞贴壁数、细胞开始伸展时间、基质细胞集落开始形成及达最大的时间、细胞融合时间及培养成功率上明显优于3%明胶联合Ficoll分离法;两种分离法在细胞化学和免疫细胞化学、细胞形态等生物学特征无差别。2. hUCBDSCs对小鼠GVHD的体外调节作用:hUCBDSCs具有促进混合淋巴细胞培养体系中的淋巴细胞增殖的作用,hUCBDSCs联合rhIL-2促增殖作用更强(p<0.05),hUCBDSCs培养上清无促增殖作用;hUCBDSCs明显增加混合淋巴细胞培养体系中淋巴细胞S期和G2/M期的比例(p<0.05); hUCBDSCs和hBMSCs均促进CD49b NK细胞、降低CD3 T细胞和粘附分子CD49d(VLA-4)的表达,hUCBDSCs的作用更强(p<0.05);hUCBDSCs和hBMSCs均促进IL-4、降低IFN-γ表达,hUCBDSCs的作用更强(p<0.05);hUCBDSCs具有抑制CD49bIFN-γNK1和CD49bIL-4 NK2细胞的表达;随着培养时间的延长,粘附于hUCBDSCs的淋巴细胞越来越少,粘附细胞通过伪足与hUCBDSCs紧密粘附,部分细胞伸到hUCBDSCs下层;在第7天粘附的CD3 T细胞和CD49b NK细胞均明显少于第3天。3.成功构建HLA半相合造血干细胞移植小鼠GVHD模型。4.hUCBDSCs促进HLA半相合造血干细胞移植小鼠造血重建。5. hUCBDSCs对HLA半相合移植小鼠GVHD的调节作用:hUCBDSCs明显降低小鼠的死亡率,延长其生存期(p<0.05);组织病理学评分及GVHD临床积分均显示联合hUCBDSCs移植组小鼠GVHD发生程度明显低于单纯BMT组(p<0.05);联合hUCBDSCs移植明显促进受体小鼠外周血中IL-4表达,抑制IFN-γ表达(p<0.05);联合hUCBDSCs移植增加受体小鼠脾脏CD49b NK细胞、降低CD3 T细胞及粘附分子CD49d的表达(p<0.05);联合hUCBDSCs移植明显降低GVHD靶器官粘附分子CD49d (VLA-4)的表达(p<0.05)。6. CM-DiI标记的hUCBDSCs早期在HLA半相合造血干细胞移植小鼠的大多数器官中表达,其后主要在骨髓、免疫器官脾脏及皮肤、肝脏及小肠等GVHD主要靶器官中持续表达,而在其它器官中,表达逐渐减弱,甚至消失。三、结论1.在本实验条件下,改良的6%明胶联合Percoll两步分离法是hUCBDSCs原代培养的最佳分离条件;2. hUCBDSCs促进HLA半相合造血干细胞移植小鼠造血重建;3. hUCBDSCs移植后主要迁移到骨髓、脾脏及GVHD的主要靶器官;4. hUCBDSCs具有减轻GVHD的作用;hUCBDSCs通过刺激NK细胞、抑制T细胞增殖,增强IL-4、降低IFN-γ细胞因子的表达及降低粘附分子CD49d (VLA-4)的表达减轻GVHD。