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指状青霉菌（Penicillium digitatum）是一种典型的腐殖营养型病原菌,常常侵染柑橘类水果,导致绿霉病的发生。在柑橘采摘后的打包、储存、运输及售卖过程中90%的损失是由指状青霉菌引起的。咪唑类杀菌剂能够有效控制绿霉病的产生,但农药的长期使用使得菌株耐药性问题日益凸显,因此有必要研究其它相关机制来控制绿霉病的发生。本文旨在探究指状青霉细胞色素b5（Cytb5）与细胞色素b5还原酶（Cyt b5r）在细胞色素P450 CYP51A电子传递方面的功用及MATE家族转运蛋白对农药的的耐药性机制,为新型杀菌剂的研制提供理论依据。本文的主要研究结果如下:1、本文以柑橘指状青霉菌为研究材料,通过转录组分析筛选并PCR扩增获得了 cytb5与cyt b5r基因,分别命名为Pdcyt b5和Pdcytb5r。通过生物信息学软件对基因序列及基因编码的蛋白序列进行了分析,发现PdCyt b5r具有典型的核黄素结合域RXY（T/S）XX（S/N）,推测蛋白中对应位置是R301至S307。构建了原核表达质粒 pET-cyt b5、pET-cyt b5r,转化E.coli BL21 衍生菌株Rosetta Blue DE3。7℃,1 mol/L IPTG条件下诱导,两个蛋白均成功表达。2、以多基因串联克隆载体pPICZαA为骨架,构建了指状青霉共表达质粒ppbrA（pPIC-Pdcyp51A-cyt b2-cyt b5r）,电击转化法将重组质粒ppbrA导入毕赤酵母X-33中。qRT-PCR分析结果表明:诱导不同时间后,在共表达系统ppbrA/P.pastoris及其单独表达系统pPI-cyp51A/P.pastori5s中,cyp51A基因表达水平均发生上调;但在共表达系统中cyp51A转录表达水平上调显著。CYP51A与Cyt b5-Cytb5r共表达后,其基因表达水平升高54-97%,并维持较长时间（48-72 h）,各组数据之间差异极显著（**P<0.01）。这表明Cytb5-Cytb5r系统可将电子高效转移给CYP51A,从而增强cyp51A基因的转录表达。CYP51A作为抗真菌剂的靶标酶,其高水平表达与真菌耐药性密切相关。此研究对真菌抗药性机制分析及新药的设计具有重要意义。通过共表达的方式研究cyp51A基因的功能尚为首次报道。3、提取了指状青霉抗性菌株（HS-F6）和敏感菌株（HS-E3）在咪酰胺诱导前后总RNA,进行转录组测序。研究结果发现:咪酰胺胁迫处理抗性菌株HS-F6后有3个药物跨膜转运蛋白编码基因的表达发生了上调,而咪酰胺胁迫处理后敏感菌株HS-E3后这3个基因的表达并没有发生变化。同源序列比对（NCBI Blast）推定其属于MATE家族。PCR扩增获得了 3个MATE蛋白基因的全长序列,分别是Pdmatel（PDIG42350m.01）全长 933bp、Pdmate2（PDIG35850m.01）全长 862bp、Pdmate3（PDIG25390m.01）全长 1477bp。这 3 个 MATE 蛋白同源性为23.73%-36.60%。运用Real-time荧光定量PCR对基因表达进行验证:在咪酰胺诱导6 h后,抗性菌株HS-F6中3个Pdmate基因的表达量均上调,其中Pdmate2上调幅度最大,其次是Pdmate3基因;而在敏感菌株HS-E3中,3个Pdmate基因的表达量均下调。同样的,抑霉唑诱导6 h,抗性菌株HS-F6中3个Pdmate基因的表达量均上调,其中Pdmate1上调幅度最大;而在敏感菌株HS-E3中3个Pdmate基因的表达量均下调。这些结果与转录组分析结果一致。3个Pdmate基因对咪酰胺和抑霉唑诱导响应结果不同,但均有上调,意味着这3个基因对不同药物的敏感性及特异性不同。PdMATE转运蛋白的过量表达很可能与指状青霉抗性菌株HS-F6的耐药性相关。4、缺失突变是探究MATE转运蛋白功能的有效方法。通过农杆菌介导的转化法构建了敲除Pdmate2的突变体,为进一步研究MATE家族转运蛋白对指状青霉菌产孢率、毒力等方面的影响及探究其耐药性机制打下了基础。