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作为天然药发挥药效活性的物质基础,天然活性成分往往含量很低。大量研究表明,20(S)-吡喃葡萄糖基原人参二醇(CompoundK,简称C-K)具有显著的抗癌作用。但C-K在天然人参中并不存在,为人参皂苷的微生物代谢产物。由于C-K获取困难,要进行药物开发必需的公斤级量几乎是不可能的。而且传统的酸法和碱法水解人参皂苷,无法获得C-K。因此利用生物转化的方法将含量较高但生理活性较低的原生皂苷转化为活性较高的次生皂苷,并提高其含量,使其开发为新药成为可能,必将具有重大的社会意义和极大的经济价值。基于以上原因,本实验通过对7种底物及4种酶的筛选,最终选择了二醇组皂苷含量很高的西洋参果苷作为转化对象,并系统地进行了提高酶活性的方法学研究,获得了比较理想的研究结果。
由于我国每年都能获得大量的西洋参果实,而生产部门只是取出果实中的种子用于繁殖,而将果肉作为废物扔掉,既浪费资源又污染环境。所以本研究以西洋参果苷为底物,对其进行酶转化制备稀有人参皂C-K,为开发利用果实提供理论依据。
本实验研究了β-葡聚糖苷酶转化西洋参果苷的单条件实验和正交实验,确定出β-葡聚糖苷酶转化西洋参果苷的最佳转化条件为温度为55℃,pH为5.5,反应时间为48h,底物浓度为20mg/mL,酶浓度为10%。
在以上研究的基础上,对影响β-葡聚糖苷酶活性的因素进行考察,主要选择了超声波、微波、气浴振荡、添加有机溶剂及有机相中超声等5种方法。实验结果表明:120W、40KHz的超声波对β-葡聚糖苷酶转化西洋参果苷有明显的促进作用,超声4hC-K的生成量为33.156mg/g,相当于水浴反应24h的C-K生成量;700W、2450MHz的微波对β-葡聚糖苷酶的转化活性并没有促进作用,而且由于微波作用的温度很难控制,致使酶在作用2min后就凝固变性,失活;与水浴加热相比在相同温度、相同时间条件下,气浴振荡对β-葡聚糖苷酶的转化有明显的促进作用,通过振荡所生成的C-K比不振荡的C-K生成量多,反应2h时,振荡比不振荡C-K的生成量增加了168.6%,反应4h增加108.6%,8h增加53.2%,24h增加23.3%;浓度小于40%的乙醇溶液不会使β-葡聚糖苷酶失活,而50%以上的乙醇溶液会使β-葡聚糖苷酶凝固失活;用20%的乙醇溶液配制的酶溶液转化后C-K的生成量最大,可达C-K70.306mg/g,比水相中C-K的生成量增加了17%左右;在4h内,超声波对有机相中(不同浓度的乙醇反应液中)β-葡聚糖苷酶的催化活性没有促进作用,作用前后C-K含量变化不明显。