目的:胸腺是机体重要的免疫器官,是孵育T淋巴细胞成熟的场所,来自骨髓的淋巴造血祖细胞(lymphohematopoietic progenitor cell,LPC)经过血液循环进入胸腺,与胸腺微环境相互作用并逐步向成熟的T淋巴细胞发育,最终经胸腺移行到外周的免疫器官并发挥免疫调节功能。胸腺在青春期时重量达到最大,随后便开始发生增龄性萎缩,是机体最早发生衰老的器官,胸腺老化主要表现为明显的萎缩,以腺体变小,重量减低,细胞结构破坏和脂肪细胞的积累为特征。胸腺增龄性萎缩会引起免疫系统衰老和应答免疫系统功能低下,进而导致自身免疫性疾病的发生、增加机体罹患癌症及感染性疾病的危险。近些年的研究表明,许多老年人常见的疾病,如糖尿病、心血管疾病等也可能与胸腺功能减退导致的免疫功能下降相关。胸腺基质细胞是胸腺微环境的主要组成部分,包含胸腺上皮细胞(thymus epithelial cell,TEC)、成纤维细胞、巨噬细胞、树突状细胞(deutrtic cell,DC)等,有研究表明,胸腺内的脂肪细胞主要是由成纤维细胞分化发育而来,然而胸腺内的成纤维细胞向脂肪细胞分化发育的机制却并不清楚。因此研究胸腺脂肪化的分子机制,为进一步探究胸腺的发育和萎缩的分子机制,对提高机体免疫力、延缓免疫系统衰老至关重要。研究方法:1、原代胸腺基质细胞的培养及鉴定:选取出生3天内的小鼠胸腺,利用酶消化方法提取原代的小鼠胸腺基质细胞(thymic stromal cell,TSC),流式细胞术及细胞免疫荧光染色检测细胞的表型。使用过氧化物酶体增殖激活物受体γ(peroxisome proliferators-activated receptorγ,PPARγ)的激动剂罗格列酮,诱导体外培养的TSCs分化成为脂肪细胞,二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)处理的细胞作为对照,油红O染色检测脂滴的形成情况,Real-time PCR检测成脂相关基因PPARγ、FABP4(fatty acid binding protein 4)的mRNA表达水平。2、TSCs向脂肪细胞分化过程中差异表达lncRNA和mRNA的筛选:DMSO组及罗格列酮诱导组各取三组样本,采用高通量测序技术(High-throughput Sequencing),以筛选的阈值为qvalue<0.05(若qvalue<0.05筛选差异基因过少则使用pvalue<0.05进行差异筛选)作为筛选TSCs向脂肪细胞分化过程中差异表达的lncRNA和mRNA标准,并对筛选后差异表达的lncRNA和mRNA进行非监督层次聚类分析、GO分析(gene ontology,GO)和KEGG分析(kyoto encyclopedia of genes and genomes),使用Real-time PCR验证所筛选出的与成脂相关基因的表达变化。3、Notch信号通路在TSCs向脂肪细胞分化过程中的作用:使用Real-time PCR检测在罗格列酮将TSCs诱导分化成为脂肪细胞的过程中Notch信号通路受体(Notch1~4)、配体(DLL1、DLL4、Jagged1、Jagged2)及下游靶基因(Hes1、Hey1)的表达变化,随后过表达或抑制Notch1,油红O染色和Adipored染色观察脂滴的形成,Real-time PCR检测PPARγ、FABP4的mRNA表达水平。4、Notch信号通路与自噬共同调节TSCs的脂肪化:Western blot检测罗格列酮诱导TSCs后0、1、3、5、7天时自噬相关蛋白LC3、p62的蛋白表达水平。Western blot检测不同浓度的Notch信号通路抑制剂DAPT(0、1、2、5、10μm)处理TSCs后自噬相关蛋白LC3、p62及自噬相关通路p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR的蛋白表达水平。在罗格列酮诱导TSCs的过程中同时使用Notch信号通路抑制剂DAPT及自噬抑制剂3-MA,油红O染色和Adipored染色观察脂滴的形成情况,Real-time PCR检测PPARγ、FABP4的mRNA表达水平。结果:1、原代TSCs的提取与鉴定:提取的原代TSCs大多数呈成纤维细胞样,流式细胞术结果显示约97%的细胞呈CD45~-S100A4~+表型,细胞免疫荧光结果也显示多数的细胞呈S100A4~+表型,说明多数的TSCs为成纤维细胞;2、罗格列酮诱导原代TSCs向脂肪细胞分化:分别用DMSO和10μm罗格列酮对TSCs进行处理,(1)油红O染色结果DMSO对照组中并无脂滴形成,而罗格列酮处理组有大量的脂滴出现;(2)Real-time PCR检测脂肪形成相关基因PPARγ与FABP4的mRNA水平,发现罗格列酮诱导组中,两个基因的表达较对照组明显增高;3、筛选TSCs向脂肪细胞转分化过程中差异表达的lncRNA及mRNA:(1)高通量测序一共筛选出1737个差异表达的mRNA(965个上调和772个下调)、45个差异表达的lncRNA(29个上调和16个下调)和31个差异表达的不确定编码潜能的转录本(transcripts of uncertain coding potential,TUCP)(14个上调和17个下调);(2)利用非监督层次聚类的方法对差异表达基因进行分析,分别使用差异表达的lncRNA、TUCP的靶基因和mRNA产生热图,它们清楚地被分离成Rosi和对照簇,同组样本聚在同一簇中;(3)GO显著性富集分析结果显示筛选得到的差异基因无论是mRNA、lncRNA还是TUCP都主要是在细胞代谢、有机物质代谢、氮化合物代谢等过程中显著富集;(4)筛选得到的差异mRNA在PPARγ、胰岛素、环磷酸腺苷(Cyclic Adenosine monophosphate,cAMP)及泛素化介导的蛋白水解相关的信号通路发生显著富集,筛选到的差异lncRNA主要在丝裂原活化蛋白激酶(Mtogen-activated protein kinase,MAPK)、泛素化蛋白水解、过氧化物等信号通路发生显著富集,筛选到的差异TUCP在癌症、神经营养因子等信号通路发生显著富集;4、Notch信号通路在TSCs脂肪化中的作用:(1)Real-time PCR检测结果显示在TSCs向脂肪细胞分化过程中Notch信号通路的受体Notch1、配体Jagged1及靶基因Hey1的表达下降,而配体DLL1的表达升高;(2)构建携带Notch1基因的腺病毒,并转入TSCs中,Western Blot结果显示Notch1过表达后,胞浆内Notch1及胞核内Notch1活化片段N1ICD的蛋白水平表达升高,Real-time PCR结果显示Notch信号通路下游靶基因Hey1的表达升高;(3)对过表达Notch1基因的TSCs进行罗格列酮诱导,油红O染色和AdipoRed染色结果显示脂肪滴的形成受到抑制。Real-time PCR检测结果显示成脂相关基因FABP4的mRNA表达水平出现下降;(4)DAPT和si-Notch1作用于TSCs,胞浆内Notch1及胞核中N1ICD的蛋白水平下降,同时Notch信号通路的下游靶基因Hey1的mRNA水平也出现下降;(5)DAPT和si-Notch1抑制Notch信号通路的同时添加罗格列酮诱导TSCs向脂肪细胞分化,油红O染色和AdipoRed染色结果显示脂肪滴的形成增多,成脂相关因子PPARγ及FABP4的mRNA表达水平在抑制Notch信号通路后表达出现上升;5:Notch信号通路与自噬共同调节TSCs向脂肪细胞分化:(1)分别在罗格列酮处理TSCs后的第0、1、3、5、7天收集细胞并提取蛋白,western blot实验结果显示自噬相关指标LC3、Becline1蛋白水平无明显变化,p62的蛋白表达水平降低;(2)用不同浓度的DAPT(0、1、2、5、10μm)对TSCs进行处理,48h后收集细胞并提取蛋白,western blot实验结果显示自噬相关指标LC3-II/LC3-I随DAPT浓度的增高而呈现逐渐增长的趋势,p62蛋白水平出现了降低,p-AKT/AKT与p-mTOR/mTOR的蛋白表达水平降低;(3)添加自噬的抑制剂3-MA,同时添加或不添加Notch信号通路抑制剂DAPT,油红O染色和AdipoRed染色结果显示使用3-MA抑制自噬后脂肪滴的形成减少,同时还可以部分逆转DAPT导致的脂肪滴形成的增加,在DAPT处理TSCs的同时添加了3-MA,PPARγ及FABP4的表达较单独使用DAPT组下降。结论:1、在罗格列酮诱导的TSCs向脂肪细胞分化过程中有1737个mRNA(965个上调和772个下调)、45个lncRNA(29个上调和16个下调)和31个TUCP(14个上调和17个下调)表达发生明显的改变;2、调节Notch信号通路水平可以影响TSCs向脂肪细胞分化的过程;3、抑制Notch信号通路可通过提高自噬水平来促进TSCs向脂肪细胞的分化。