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目的：本研究选取副溶血弧菌T6SS1（VP1386-1414）上若干操纵子（VP1388-1390， VP1393-1399，VP1400-1405及VP1409-1406）的首基因和T6SS2（VPA1024-1046）上各操纵子（VPA1027-1024, VPA1043-1028及 VPA1044-1046）的首基因为研究对象，利用表型实验和分子生物学实验研究LysR型转录调节因子CalR对T6SSs的转录调控机制，为我们进一步理解副溶血弧菌的致病机制提供一定的理论基础。 方法： 1.抑菌实验：选取本课题组前期构建的副溶血弧菌野生株、缺陷株及回补株菌体（WT-pBAD33，ΔcalR-pBAD33及C-ΔcalR）。将等量WT-pBAD33，ΔcalR-pBAD33及C-ΔcalR分别与大肠杆菌S17-pBAD33按特定比例混和后，置37℃下静置共孵育4 h，用不同浓度的抗生素筛选，以0 h的菌落计数为参照，观察各菌株4 h后的菌量变化，从而分析CalR是否调控副溶血弧菌的抑菌能力。 2.细胞粘附实验：取等量WT-pBAD33，ΔcalR-pBAD33及C-ΔcalR菌株，分别加入等量的HeLa细胞预培养物中，置于37℃、含5%CO2的孵箱中培养90 min后取出，用PBS洗涤细胞三次，0.5%的曲拉通作用10 min，离心15 min，弃上清，沉淀用DMEM稀释合适倍数后涂板计数，即为粘附于HeLa细胞表面的细菌数。通过比较各菌株之间粘附率的差异，来分析CalR是否调控副溶血弧菌的粘附能力。 3. LacZ报告基因融合实验：将各靶基因的启动子区序列克隆入pHRP309质粒多克隆位点内的两个酶切位点之间、不含启动子区的β-半乳糖苷酶基因的上游，获得重组质粒，并将其转入WT和ΔcalR中，通过比较二者所含β-半乳糖苷酶的差异来判断CalR对相应靶基因启动子的调控作用。 4.实时荧光PCR技术(qRT-PCR)：以看家基因16S rRNA为参照对靶基因进行相对定量。实时荧光PCR技术可分析靶基因在WT与ΔcalR中的差异表达情况。 5.引物延伸：把特异性引物的5’末端用[γ-32P]标记，并将该引物退火，使其与mRNA链的互补区域相结合，在逆转录AMV酶的作用下延伸成cDNA，同时利用相同的末端标记引物对相应的DNA片段进行测序，随后进行6.0%的聚丙烯酰胺变性胶凝胶电泳，放射自显影进行分析。引物延伸实验可根据测序条带鉴定出靶基因的转录起始位点（+1）以及-10至-35区的RNA酶结合位点，并且分析野生株和缺陷株的基因转录表达差异。 6.蛋白的表达及纯化：构建pET28a-蛋白重组载体，并将成功构建的阳性载体热击转化入E. coli DH5α感受态以长期保存重组质粒。再提取重组载体热击入BL21以表达目的蛋白，进行筛选验证。用IPTG诱导阳性菌株，不同的蛋白摸索适宜的表达条件，再超声破菌后离心取上清，进行Ni-柱亲和层析，从而分离及纯化目的蛋白，-70℃保存。 7.凝胶阻滞实验：将DNA启动子区域片段与调控子蛋白CalR共孵育20 min，随后再用6%非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳，最终用凝胶成像仪分析检测CalR与DNA片段的结合情况。 8.竞争性凝胶阻滞实验：在靶DNA片段与调控子蛋白CalR共孵育的体系中加入另一蛋白H-NS，用阴性对照和阳性对照寻找到各蛋白与靶基因相互作用的最适浓度后，保持一个蛋白的浓度不变，逐渐增加另一蛋白的浓度来观察结合情况，反之亦然。而后用5.0%的聚丙烯酰胺非变性胶进行凝胶电泳，分析CalR与H-NS是否存在竞争关系。 结果： 1. CalR能直接激活VP1388、VP1393、VP1400和VP1409的转录。 1）抑菌实验结果显示ΔcalR-pBAD33对大肠杆菌的抑菌能力明显低于WT-pBAD33和C-ΔcalR的，而WT-pBAD33和C-ΔcalR之间无显著性差异，说明CalR正调控副溶血弧菌的抑菌活性。 2）分子生物学实验研究CalR对T6SS1相关基因VP1388、VP1393、VP1400和VP1409的转录调控机制。qRT-PCR实验结果表明CalR能激活上述基因的转录；LacZ报告基因融合实验结果显示CalR能激活上述基因的启动子区活性；体外的凝胶阻滞实验结果表明重组蛋白His-CalR能特异性的结合到上述基因的启动子区。 2. CalR能直接激活VPA1027、VPA1043和VPA1044的转录。 1）细胞粘附实验结果表明ΔcalR-pBAD33对HeLa细胞的粘附活性明显低于WT-pBAD33和C-ΔcalR的，而WT-pBAD33和C-ΔcalR之间无显著性差异，提示CalR正调控副溶血弧菌的细胞粘附活性。 2）分子生物学实验研究 CalR对 T6SS2相关基因 VPA1027、VPA1043和VPA1044的转录调控机制。引物延伸结果显示VPA1027、VPA1043和VPA1044的转录起始位点分别位于编码区上游C（-104）、T（-120）以及C（-36）（翻译起始位点为+1），且它们的转录活性均受CalR的激活；而qRT-PCR和LacZ报告基因融合实验进一步证明了 CalR确实能激活 VPA1027、VPA1043和VPA1044的转录。体外的凝胶阻滞实验结果表明His-CalR能特异性结合到VPA1027、VPA1043和VPA1044启动子区，且His-CalR的结合能拮抗His-H-NS对它们的结合。 结论： 1. CalR通过直接正调控T6SS1的表达来激活副溶血弧菌的抑菌活性； 2. CalR通过直接正调控T6SS2的表达来激活副溶血弧菌的细胞粘附活性； 3.副溶血弧菌CalR是抑制因子H-NS的拮抗因子，可以通过竞争H-NS对靶基因启动子区的结合位点而激活T6SS2基因的转录。