PEDV和TGEV的S蛋白融合抗原表位核酸疫苗的研究

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猪流行性腹泻病毒(PEDV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)均可感染各个年龄段的猪,尤其对哺乳仔猪的致死率极高,给我国养猪业造成严重影响。S蛋白是位于PEDV和TGEV病毒粒子囊膜表面的纤突糖蛋白,是诱导机体产生抗病毒中和抗体的主要靶标。S基因是目前研究PEDV和TGEV疫苗的重要靶标抗原基因。由于PEDV和TGEV的S基因容易发生变异,导致目前的灭活和弱毒苗的免疫保护效力降低,因此亟需更安全高效的疫苗。PEDV S蛋白中的COE区域和TGEV S蛋白的A、D抗原位点结构稳定、高度保守并且具有良好的免疫原性,是诱导机体产生中和抗体的主要结构域。核酸疫苗具备亚单位疫苗的安全性和弱毒疫苗的时效性,能够更好地激起机体的体液和细胞免疫应答。在小鼠模型中PEDV和TGEV的核酸疫苗均能够刺激小鼠产生保护性中和抗体及细胞免疫应答。如何有效的提高核酸疫苗抗原的免疫原性,一直是该疫苗研发的关键。大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基(LTB)是一种能够增强机体免疫应答的新型疫苗免疫佐剂。目前为止未见有将LTB作为TGEV和PEDV核酸疫苗佐剂的相关研究报道。本研究开展了关于TGEV和PEDV的S蛋白的融合基因和LTB基因作为核酸疫苗佐剂的研究。具体的研究方法和结果如下:本研究将PEDV(CV777)的COE基因(AF353511.1)与TGEV S基因(AJ271965.2)的A、D抗原位点基因通过柔性Linker序列融合连接作为抗原基因,将大肠杆菌热不稳定肠毒素亚基B亚基(S60731.1)的基因作为免疫佐剂分子。利用双顺反子真核表达载体pIRES构建携带有LTB基因的pLTB、携带有PEDV COE与TGEV S蛋白A、D位点融合基因的pPT及同时携带有PEDV COE和TGEV S蛋白A、D融合位点基因与LTB基因的pPT-LTB重组真核质粒。将阳性重组真核表达质粒转染至BHK-21细胞,经Western Blot鉴定上述重组质粒在体外的表达情况。实验结果表明重组真核质粒能够在体外成功表达。以昆明小鼠为动物模型,将重组质粒通过肌肉注射途径免疫并研究其免疫效果。将6-8周龄的雌性昆明小鼠分为6组,分别为PBS组、pIRES(载体)组、pLTB组、pPT组和pPT-LTB组以及PEDV/TGEV二联活疫苗(YM)组,每组20只,每只小鼠肌肉注射100μl重组阳性质粒,总共免疫三次,每次免疫间隔时间为2周。采集免疫后各个时间点各组免疫小鼠的外周血和脾脏,通过分析测定体液和细胞免疫水平来评价其免疫效果。在T淋巴细胞增殖检测、特异性细胞毒性T淋巴细胞检测、特异性IgG和中和抗体水平检测中,YM组的值最高,其次是pPT-LTB组。pPT、pPT-LTB组与PBS、pIRES和pLTB组相比均有明显差异,其中pPT-LTB组差异尤其显著,与pPT组相比有极显著的差异(p﹤0.01)。在IFN-γ和IL-4检测中,pLTB、pPT和pPT-LTB组均有明显升高,与PBS和pIRES组相比有极显著的差异(P﹤0.01)。与pLTB组相比,在IFN-γ含量检测中发现,pPT、pPT-LTB组有极显著的差异(P﹤0.01),在IL-4含量检测中,pPT、pPT-LTB有显著的差异(P﹤0.05)。pPT、pPT-LTB相比,IFN-γ含量有极显著的差异(P﹤0.01)而IL-4含量无统计学差异(P﹥0.05)。说明LTB能够作为佐剂分子显著提高PT真核表达质粒的免疫效果。本研究首次利用真核表达载体pIRES将融合的PEDV COE基因与TGEV S蛋白A、D抗原基因与LTB佐剂基因共同表达。结果表明本研究所构建的重组核酸疫苗具有良好的免疫原性,LTB能够作为佐剂分子显著提高机体的细胞和体液免疫应答水平,从而提高机体的抗病毒能力。为新型PEDV/TGEV二联核酸疫苗的研究进一步提供理论依据。
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