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九分散出自清·费山寿《急救应验良方》,历版《中国药典》均有收载,具有活血散瘀,消肿止痛功效。可用于跌扑损伤,瘀血肿痛。临床主要用于治疗类风湿性关节炎,可口服也可外用,其处方组成为马钱子、麻黄、乳香、没药。中药经皮给药具有悠久的历史,常用芳香药味,这些药味多含挥发性成分,可“率领中药,直达病所”,推测乳香、没药在方中具有类似现代经皮给药中促透剂的作用。本论文选择马钱子中马钱子碱、士的宁生物碱与麻黄中盐酸麻黄碱生物碱作为研究对象,探讨乳香没药挥发油对这3种生物碱的经皮吸收行为的影响,从而为九分散外用制剂的开发提供参考。同时对乳香没药挥发油的成分、促透机制进行了探讨,为乳香没药挥发油的使用提供依据。1.乳香没药挥发油GC-MS比较分析采用GC-MS技术分别对乳香、没药、药对、混合组的挥发油进行分析。乳香挥发油中鉴定出26种成分,占挥发油总量的82.54%,其中相对含量较大且超过1%的有乙酸辛酯(27.91%)、反式-橙花叔醇(25.84%)、右旋萜二烯(4.48%)、正辛醇(2.70%)、芳樟醇(1.29%)、月桂酸(1.34%)、Neocembren A(4.31%)、D2-Carene(2.63%)等成分共8个,占挥发油总量的70.5%;没药挥发油中鉴定出20种成分,占挥发油总量的79.28%,其中相对含量较大且超过1%的有4-ethenyl-4-methyl-1-(propan-2-yl)-3-(prop-1-en-2-yl)cyclohexene(14.45%)、大根香叶烯(20.01%)、α-蒎烯(6.40%)、α-波旁烯(2.76%)、β-依兰烯(2.03%)、(-)-g-榄香烯(1.53%)、β-桉叶烯(1.14%)、莪术烯(5.59%)、Naphthalene,1,2,4a,5,6,8a-hexahydro-4,7-dimethyl-1-(1-methylethyl)-(1.09%)、d-杜松烯(3.03%)、α-榄香醇(1.53%)、β-榄香烯(10.39%)、花柏烯(2.20%)、甘香烯(2.75%)等成分共14个,占挥发油总量的74.9%;药对挥发油中鉴定出29种成分,占挥发油总量的73.36%,其中相对含量较大且超过1%的有乙酸辛酯(13.98%)、大根香叶烯(8.21%)、反式-橙花叔醇(10.96%)、β-榄香烯(7.89%)、α-蒎烯(3.29%)、α-波旁烯(2.53%)、4-ethenyl-4-methyl-1-(propan-2-yl)-3-(prop-1-en-2-yl)cyclohexene(5.54%)、β-依兰烯(1.43%)、(-)-g-榄香烯(2.54%)、β-桉叶烯(1.01%)、(-)-α-蛇床烯(2.96%)、d-杜松烯(2.64%)、α-榄香醇(1.05%)、D2-Carene(1.55%)等成分共14个,占挥发油总量的65.58%;混合挥发油中鉴定出36种成分,占挥发油总量的76.59%,其中相对含量较大且超过1%的有乙酸辛酯(13.53%)、大根香叶烯(10.28%)、反式-橙花叔醇(12.46%)、右旋萜二烯(1.80%)、正辛醇(1.11%)、α-蒎烯(3.14%)、4-ethenyl-4-methyl-1-(propan-2-yl)-3-(prop-1-en-2-yl)cyclohexene(6.18%)、(-)-β-波旁烯(1.44%)、β-依兰烯(1.08%)、(-)-g-榄香烯(2.23%)、莪术烯(3.38%)、d-杜松烯(1.47%)、β-榄香烯(3.85%)、D2-Carene(1.08%)等成分共14个,占挥发油总量的63.03%。分析这4种挥发油中含量较高的成分,乳香中含量较高的乙酸辛酯、反式-橙花叔醇这2种化学成分在作为药对配伍的挥发油还是混合挥发油中,含量变化不大;没药中最高含量的是大根香叶烯,在药对中略有减少,在混合中几乎不变;其他成分发生了一定程度上的含量及种类变化。利用主成分分析法分析乳香组、药对组、混合组挥发油的化学成分,发现乙酸辛酯、右旋萜二烯、正辛醇、芳樟醇、反式-橙花叔醇等5种化学成分为乳香在药对、混合组中起到主要作用的成分;分析没药组、药对组、混合组挥发油的化学成分,发现大根香叶烯、α-荜澄茄油烯、β-依兰烯、opropa[1,2]benzene、Naphthalene,1,2,4a,5,6,8a-hexahydro-4,7-dimethyl-1-(1-methylethyl)-、α-石竹烯、β-桉叶烯、d-杜松烯、α-榄香醇、β-榄香烯、α-古芸烯、莪术烯等12种化学成分为没药在药对、混合组中起到主要作用的成分。2.九分散中乳香没药挥发油对生物碱的体外经皮渗透影响研究建立马钱子碱、士的宁、盐酸麻黄碱的HPLC测定含量方法,设置不同挥发油组别、阴性对照溶剂组和阳性对照氮酮组,采用Franz扩散池法考察挥发油作用下单独给药(含单一生物碱)、共同给药(含3种生物碱)时马钱子碱、士的宁、盐酸麻黄碱的经皮吸收行为。实验结果显示单独给药时马钱子碱的经皮吸收符合Higuchi方程,溶剂组的马钱子碱12 h的累计透皮量为56.72±0.58μg/cm~2,乳香组、没药组、药对组、混合组、氮酮组分别为114.85±7.19、113.40±27.58、120.69±21.44、97.71±6.98、135.06±4.39μg/cm~2、各组挥发油的促透倍数为2.13、1.94、2.14、1.68,氮酮组为2.87,均大于1。表明乳香、没药挥发油单用、配伍及混合均对马钱子碱有一定促透作用,且无显著差异,与阳性对照氮酮组相似。单独给药时士的宁的经皮吸收符合Higuchi方程,溶剂组的士的宁12h的累计透皮量为186.88±19.82μg/cm~2,乳香组、没药组、药对组、混合组、氮酮组分别为291.09±11.37、288.42±9.47、268.78±30.27、249.90±10.08、236.14±12.41μg/cm~2、各组挥发油的促透倍数为1.58、1.61、1.55、1.51,氮酮组为1.34,均大于1。表明乳香、没药挥发油单用、配伍及混合均对士的宁有一定促透作用,且无显著差异,与阳性对照氮酮组相似。单独给药时盐酸麻黄碱的经皮吸收符合Higuchi方程,溶剂组的盐酸麻黄碱12h的累计透皮量为26.33±3.68μg/cm~2,乳香组、没药组、药对组、混合组、氮酮组分别为114.22±7.99、105.49±12.02、112.55±4.86、96.18±5.18、110.80±1.70μg/cm~2、各组挥发油的促透倍数为3.42、3.29、3.37、3.18,氮酮组为3.59,均大于1。表明乳香、没药挥发油单用、配伍及混合均对盐酸麻黄碱有一定促透作用,且无显著差异,与阳性对照氮酮组相似。实验结果显示共同给药时马钱子碱的经皮吸收符合Higuchi方程,溶剂组的马钱子碱12h的累计透皮量为48.75±14.63μg/cm~2,乳香组、没药组、药对组、混合组、氮酮组分别为73.08±12.40、63.02±7.24、82.77±14.21、85.60±15.16、73.80±2.08μg/cm~2、各组挥发油的促透倍数为1.44、1.29、1.57、1.71,氮酮组为1.63,均大于1。表明乳香、没药挥发油单用、配伍及混合均对马钱子碱有一定促透作用,且无显著差异,与阳性对照氮酮组相似。与单独给药时对比,乳香组促透倍数显著性下降,初步考虑为马钱子碱的经皮渗透受到其他两种生物碱的影响。共同给药时士的宁的经皮吸收符合Higuchi方程,溶剂组的士的宁12h的累计透皮量为137.71±20.71μg/cm~2,乳香组、没药组、药对组、混合组、氮酮组分别为209.00±17.39、177.14±9.46、206.46±16.29、192.94±16.09、211.86±11.54μg/cm~2、各组挥发油的促透倍数为1.46、1.28、1.37、1.39,氮酮组为1.61,均大于1。表明乳香、没药挥发油单用、配伍及混合均对士的宁有一定促透作用,且无显著差异,与阳性对照氮酮组相似。与单独给药时对比,没药组促透倍数显著性下降,初步考虑为士的宁的经皮渗透受到其他两种生物碱的影响。共同给药时盐酸麻黄碱的经皮吸收符合Higuchi方程,溶剂组的盐酸麻黄碱12h的累计透皮量为72.82±18.30μg/cm~2,乳香组、没药组、药对组、混合组、氮酮组分别为114.40±15.54、88.68±10.34、96.64±15.71、111.22±16.73、98.82±5.5μg/cm~2、各组挥发油的促透倍数为1.51、1.23、1.24、1.51,氮酮组为1.45,均大于1。表明乳香、没药挥发油单用、配伍及混合均对盐酸麻黄碱有一定促透作用,且无显著差异,与阳性对照氮酮组相似。与单独给药时对比,各挥发油组促透倍数显著性下降,初步考虑为盐酸麻黄碱的经皮渗透受到其他两种生物碱的影响。3.九分散中乳香、没药挥发油对生物碱的在体微透析经皮研究建立LC-MS/MS定量分析法并进行方法学考察,利用在体微透析技术考察挥发油对马钱子碱、士的宁、盐酸麻黄碱在体经皮渗透性的影响。结果显示LC-MS/MS定量分析法符合要求。以20%乙醇-生理盐水为灌流液,1μL/min的流速,0.5h的取样间隔时间取样,探针在体外的回收率和传递率几乎相等,故可用探针的传递率代替回收率对所得数据进行校正。结果显示,乳香、没药、药对、混合组对马钱子碱的促透倍数分别为35.86、77.59、56.98、41.79,均大于氮酮组的促透倍数3.34;乳香、没药、药对、混合组对士的宁的促透倍数分别为26.80、49.85、44.81、28.57,均大于氮酮组的促透倍数5.77;乳香、没药、药对、混合组对盐酸麻黄碱的促透倍数分别为88.83、111.50、86.25、63.33,均大于氮酮组的促透倍数19.75;且对于脂溶性生物碱马钱子碱、士的宁与水溶性生物碱盐酸麻黄碱,各挥发油组的累计透皮量与稳态流速均与阴性对照溶剂组存在显著性差异(**p<0.01),这说明各挥发油组对马钱子碱、士的宁、盐酸麻黄碱的促透效果良好,乳香、没药挥发油为两亲性促透剂。4.九分散中乳香、没药挥发油对大鼠皮肤角质层及血流的影响采用透射电镜(TEM)直接观察乳香、没药挥发油对皮肤角质层表层结构的微观形态影响。透射电镜结果显示,各挥发油组处理后的大鼠皮肤角质层层数减少,层间距离增大,表明乳香、没药挥发油可通过改变皮肤角质层微观结构的紧密程度和有序性来达到促透效果。采用激光多普勒血流监测仪(LDF),排除了麻醉对大鼠皮肤微循环血流量的影响,考察挥发油对大鼠皮肤微循环血流灌注量的影响,从皮肤微循环血流的角度探讨中药挥发油在促进药物透皮吸收这一方面的机理。结果显示,在涂抹不含药溶剂基质、含药溶剂之后10、20、30、40、50、60min时,大鼠耳部皮肤血流量与基础血流值的比值在1左右,这说明无论是溶剂基质还是含药溶液,均对大鼠耳部皮肤血流量不产生影响。在给药含挥发油的药物溶液之后10、20、30、40、50、60min时,各挥发油组的大鼠耳部皮肤血流量有明显增加,大鼠耳部皮肤血流量与基础血流值的比值基本在2左右,氮酮组对加快皮肤血流作用较弱,皮肤血流变化值稳定在1.3左右。这说明加快皮肤血流或为中药挥发油促进经皮渗透的机制之一。