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油菜是我国最重要的油料作物,杂种优势利用是提高其产量和含油量的重要途径,建立有效的杂交制种体系是油菜杂种优势利用至关重要。化学杀雄杂交制种是作物杂种优势利用的重要方式之一,具有许多优点,也存在一些缺陷。由于杀雄不彻底而导致母本自花授粉结实、因而降低杂种纯度是化学杀雄杂交制种法的一个主要缺点。为了解决该问题,我们提出了一个油菜化学杀雄杂交制种的新思路,即用化学杀雄剂对母本进行杀雄,用抗除草剂的品种作父本对其进行授粉杂交,获得杂种,再在育苗时用抗除草剂喷洒杂交种子萌发的幼苗以清除非杂种苗,从而可以保证大田生产栽培的幼苗均为真正的杂种苗,可以确保F1代的杂种优势。为了开展相关研究,本课题开展了以下研究工作:1、油菜新种质12WH318的抗除草剂性状遗传与分子机制研究本课题组选出的油菜新种质12WH318具有抗除草剂咪唑啉酮的特性。通过12WH318与4个除草剂敏感型油菜品种进行正反交、F1自交、F1代与12WH318回交,并测定杂交F1、自交F2和回交一代BC1植株的抗咪唑啉酮能力,证明了 12WH318抗咪唑啉酮的特性是由一对核基因控制,呈完全显性遗传,无细胞质效应。由于咪唑啉酮类除草剂的作用靶标是乙酰乳酸合成酶(ALS),利用同源克隆方法从12WH318和3个非抗性油菜品种中获得了油菜BnALS基因家族中3个基因,BnALS1、BnALS2和BnALS3。序列分析发现12WH318的BnALS2和BnALS3序列与非抗性油菜的BnALS2和BnALS3序列完全一致,而12WH318的BnALS1在+1913位碱基由G突变为A,致使蛋白序列的第638位氨基酸由丝氨酸变为天冬酰胺酸。基因表达分析表明,除草剂处理后12WH318叶片中BnALS1表达量急剧升高,但4天后的表达量与对照无显著差异。2、油菜双单倍体的再生为了改良12WH318的生育期,提高抗除草剂父本的综合性状和配合力,选用4个(Lisandra×12WH318)×Lisandra、(ZS9×12WH318)×ZS9、(ZS1O×12WH318)×ZS10 和(QY14×12WH318)×QY14组合的BC1分离世代群体作为材料进行了小孢子离体培养。结果表明只有(ZS1O×12WH318)×ZS10组合的小孢子成功再生了单倍体植株,用2.5 g/L秋水仙碱处理5 h对213株单倍体植株进行加倍后,移栽至大田存活149株,存活率为70.0%,可育自交结实57株,加倍率为38.3%。DH群体的获得为培育综合性状优良的抗除草剂父本品种提供了选育材料。3、转抗除草剂基因油菜种质Z7B10的来源基础利用农杆菌介导法将抗除草剂基因bar转入除草剂敏感型油菜品种中双7号中,获得了再生植株。利用PCR方法对再生植株进行鉴定,筛选得到转基因植株。进一步用Sothern blot方法测定了部分转基因植株中的bar基因拷贝数,筛选得到了单拷贝的转基因植株。对其中一株进行套袋杂交,获得了纯合的转基因株系Z7B10,并对其进行除草剂的抗性与耐性试验。4、新型油菜化学杀雄杂交体系技术研究在花粉单核期,用 4 个苯磺隆浓度(0.00 mg/L、0.05 mg/L、0.075 mg/L、0.10 mg/L)喷施中双7号、中双9号、中双11号、恩油4号、青油14号和绵航油9号等6个甘蓝型油菜品种的叶面,通过考察各个油菜品种处理植株的花粉败育情况、生理指标、农艺性状和含油量等指标,确定苯磺隆喷施的最适浓度为0.1 mg/L。以中双4号、中双10号和中双12号为母本,用0.1 mg/L苯磺隆对其进行化学杀雄,分别与抗草胺勝的转基因株系Z7B10(父本)进行杂交,杂种产量分别为652.8±75.15 kg/hm2(中双4号为母本)、589.8±42.75 kg/hm2(中双 10 号为母本)和 469.2±88.5 kg/hm2(中双 12 号为母本)。3个组合杂种播种萌发后,在3-4叶期喷施0.1 mg/L除草剂,假杂种全部死亡,而真杂种成活很好;3个组合的杂交种纯度分别为89.64%±1.06%(中双4号为母本),79.28%±6.58%(中双10号为母本)和81.29%±2.99%(中双12号为母本)。杂交种播种后喷施除草剂除草的同时消灭了假杂种,从而保证了杂种群体的纯度,解决了化学杀雄制种纯度不高的难题。