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第一部分甲基丙二酰辅酶A变位酶基因新错义突变功能研究目的:对8种甲基丙二酰辅酶A变位酶（methylmalonyl-Co A mutase,MCM）基因（MUT）的变异进行MCM蛋白表达量和酶活性的分析,验证这8种突变的致病性。方法:（1）选取8例甲基丙二酸血症患者的8种未报道的MUT基因错义突变（L140P、A141T、G161V、W309G、、I505T、Q514K、I597R及G723D）,利用生物信息学软件预测这些突变对MCM蛋白结构和功能的影响;（2）构建携带野生型及这8种突变型MUT c DNA的表达载体并转染293T细胞;（3）Western blot检测野生型及突变型MCM蛋白在293T细胞中的表达量;（4）UPLC检测293T细胞中野生型及突变型MCM酶活性。结果:（1）成功构建了含MUT c DNA的野生型和8种突变型（L140P、A141T、G161V、W309G、、I505T、Q514K、I597R及G723D）表达载体;（2）Real time PCR结果显示8种错义突变型质粒转染后293T细胞MUT基因m RNA水平与野生型比较无显著差异（P>0.05）;（3）western blot结果提示5种错义变异（L140P、A141T、G161V、W309G及Q514K）较野生型MCM蛋白表达量显著下降（P<0.05）,而I505T、I597R及G723D与野生型相比较无差异（P>0.05）;（4）UPLC结果提示8种错义突变型质粒转染后293T细胞的MCM蛋白酶活性（0.31±0.21、1.66±0.01、0.76±0.04、0.19±0.13、1.37±0.24、0.46±0.09、0.86±0.27和1.37±0.13nmol/min/mg protein）均较野生型（3.11±0.13 nmol/min/mg protein）减低（P均<0.05）;（5）结合患者临床表型分析,证实这8种MUT基因错义突变均为致病突变。.结论:MUT基因的8种错义突变（L140P、A141T、G161V、W309G、、I505T、Q514K、I597R及G723D）均未影响m RNA表达水平,其中5种突变导致MCM蛋白表达量降低,8种突变均导致MCM酶活性下降,均被证实为致病突变。第二部分小鼠脑神经元经MMA诱导后凋亡变化及Lnc RNA表达与凋亡信号通路中相关m RNA关系分析目的:通过表达谱芯片对甲基丙二酸（methylmalonic acid,MMA）诱导的原代小鼠皮层神经元进行检测,筛选与神经元凋亡相关的差异表达长链非编码RNA（Long noncoding RNA,Lnc RNA）及m RNA,分析Lnc RNA与凋亡信号通路中相关m RNA的关系,探讨MMA脑损伤的部分机制。方法:（1）利用不同浓度的甲基丙二酸诱导小鼠原代皮层神经元6h、12h及24h,观察神经元凋亡情况;（2）通过表达谱芯片检测甲基丙二酸诱导下差异表达的Lnc RNA及m RNA;（3）对差异表达基因进行基因功能富集（GO）分析及Pathway分析,分析与凋亡相关的Lnc RNA及m RNA;（4）分析Lnc RNA参与甲基丙二酸诱导的神经元凋亡可能途径。（5）分析Lnc RNA与凋亡信号通路中相关m RNA的关系.结果:（1）小鼠神经元经甲基丙二酸诱导后,呈现浓度及时间依赖性凋亡现象;（2）表达谱芯片筛选出与甲基丙二酸作用呈表达递增趋势的Lnc RNA 113条,m RNA248条;表达呈递减趋势的Lnc RNA 61条,m RNA191条,这些基因主要与转录调控及细胞增殖与凋亡等功能相关;（3）Pathway分析结果显示22条m RNA包含在MAPK信号通路;8条m RNA包含在P53信号通路;（4）包含在MAPK信号通路中的Atf4,、Dusp8、Hspa2等7条m RNA的表达与Lnc RNA呈显著相关;（5）6条Lnc RNA（NONMMUT041857,Know TID00005724,NONMMUT001282、NONMMUT044301、NONMMUT006249、NONMMUT062897）与Atf4表达显著相关;（6）Lnc RNA可能通过调控Atf4的表达激活了MAPK信号通路中的一系列凋亡相关基因（p-JNK、c-Jun及p-Akt等）的表达,导致神经元的凋亡。结论:（1）本研究进一步证实了MMA脑损伤机制之一为脑神经元凋亡;（2）MMA诱导的脑神经元凋亡途径可能通过MAPK及P53信号通路;（3）Lnc RNA可能通过调控Atf4差异表达,进而调控MAPK信号通路,参与MMA诱导的神经元凋亡,为进一步研究MMA脑损伤机制提供理论基础。