维生素D₃是一种脂溶性物质,主要储存在脂肪组织中,1,25—二羟维生素D₃是其最主要的活性形式。由于维生素D₃具有重要的生理作用,在临床上成为重要辅助用药和人们日常生活中的重要补充的营养素,其对健康,尤其对未成年儿童、老年妇女生殖健康问题更为突出。本项目研究以维生素D₃的生殖内分泌干扰作用为核心,从维生素D₃的雌激素样活性作用和维生素D₃的雌性性腺毒性、维生素D₃的雌性性腺毒性机制等方面展开研究,从而较系统、全面的研究维生素D₃的生殖内分泌干扰作用及其机制,为维生素D₃的危险性评价及防治提供科学依据,为维生素D₃的临床应用与合理补充提供指导。一、维生素D₃的子宫增重效应及其机制目的:通过未成年雌性小鼠的子宫营养试验,探讨维生素D₃的子宫增重效应及其分子机制方法:清洁级昆明种小鼠66只,21天龄,按体重随机分为6组,每组11只,暴露剂量分别为（0.00926,0.0556,0.33,2.0mg/kg VitD₃）,阳性对照组为30μg/kg雌二醇,溶剂对照为橄榄油。每天染毒一次,连续三天。观察小鼠子宫重量、脏器系数、子宫内膜腔上皮厚度、固有层腺体数量及PCNA、ER表达。结果:1.与阴性对照组比较,雌二醇组子宫湿重及脏器系数显著性升高（p＜0.05）,维生素D₃的各剂量组子宫湿重较对照组无显著性差异（p＞0.05）,但是有升高的趋势;0.0556mg/Kg、0.33mg/Kg和2.0mg/Kg VitD₃剂量组的子宫脏器系数较对照组显著性升高（p＜0.05）;雌二醇组子宫湿重及脏器系数显著高于维生素D₃的各剂量组（p＜0.01）;2.子宫内膜腔上皮厚度:雌二醇组显著高于对照组及维生素D₃的各剂量组;子宫内膜腺体数量:维生素D₃的各剂量组随染毒剂量增高而增高,0.33mg/Kg和2.0 mg/Kg剂量组及阳性对照组均高于对照组,阳性对照组显著高于维生素D₃的各剂量组（p＜0.05或p＜0.01）;3.PCNA阳性率:VitD₃各剂量和雌二醇组均显著高于对照组,雌二醇组高于VitD₃各剂量组;ER阳性率:对照组低于0.00926 mg/Kg、0.0556 mg/Kg、0.33 mg/Kg剂量组,高于2.0 mg/Kg剂量组;雌二醇组显著高于对照组及0.0556 mg/Kg、0.33 mg/Kg、2.0 mg/Kg剂量组。二、维生素D₃的雌性性腺毒性的研究目的:研究亚慢性暴露VitD₃对雌性大鼠动情周期、血清性激素水平及子宫、卵巢组织病理学影响,探讨VitD₃的雌性性腺毒性作用。方法:健康未成年雌性Wistar大鼠,清洁级,60只,体重80±5g,按体重随机分为5组,染毒剂量分别为0、0.0167、0.1、0.6、3.6mg/kg,溶剂为橄榄油。每天腹腔注射染毒1次,连续35天。实验期末,待动物进入动情期处死动物。观察指标包括体重、动情周期、子宫湿重及脏器系数、卵巢湿重及脏器系数、各级别卵泡数目、子宫内膜细胞的组织学观察、血清卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、雌二醇（E₂）和孕酮（P₄）水平。结果:1.染毒结束时最高剂量的体重显著低于其它各组,与对照组比较差别有统计学意义（p＜0.01）;2.3.6mg/kg剂量组周期时间延长,其动情间期明显长于对照组,差别有统计学意义（p＜0.05）;3.3.6mg/kg染毒组的子宫湿重及脏器系数显著低于其余各组（p＜0.01）,其卵巢湿重较对照组轻,差别有统计学意义（p＜0.01）,但卵巢脏器系数与对照组比较差别均无统计学意义（p＞0.05）。4.各剂量组闭锁卵泡数目与对照组相比,呈现上升的趋势,3.6mg/kg剂量组显著高于对照组,差别有统计学意义（p＜0.05）5.3.6mg/kg剂量组血清FSH水平低于对照组（p＜0.05）,各组LH水平和对照组相比,差别无统计学意义。各剂量组血清E₂水平和对照组相比,呈现上升的趋势,其中3.6mg/kg剂量组血清E₂显著高于对照组（p＜0.05）;各剂量组血清P₄与对照组比较差别均无统计学意义（p＞0.05）,但有下降趋势。三、维生素D₃的雌性性腺毒性的机制（一）（对卵巢性激素分泌及卵巢、子宫ER表达的影响）目的:研究VitD₃对卵巢分泌性激素和卵巢、子宫ER表达的影响,探讨VitD₃的雌性性腺毒性机制方法:1.采用正交表L16（4⁵）设计正交实验,研究VitD₃(0、10^-10、10^-7、10^-4mol/L)和动情周期（动情前期、动情期、动情后期、动情间期）对卵巢切碎组织E₂和P₄的影响。2.采用正交表L9（3⁴）设计正交实验,研究VitD₃(0、10^-7、10^-4mol/L)和时间（4、8、24h）对卵巢颗粒细胞分泌E₂和P₄的影响。3.健康未成年雌性Wistar大鼠,清洁级,50只,体重80±5g,实验动物模型同前。实验期末,待动物进入动情期处死动物。观察卵巢切碎组织体外分泌E₂和P₄水平、卵巢及子宫内膜ER表达。结果:1.体外染VitD₃可影响卵巢切碎组织体外分泌E₂（p＜0.01）,但不会影响分泌P₄（p＞0.05）,卵巢切碎组织体外分泌E₂和P₄与所处的动情周期有关（p＜0.01或p＜0.05）;2.不同浓度的VitD₃可影响颗粒细胞分泌E₂（p＜0.05）,但不会影响颗粒细胞分泌P₄（p＞0.05）;颗粒细胞分泌E₂与孵育时间无关（p＞0.05）,颗粒细胞分泌P4与孵育时间有关（p＜0.05）。3.3.6mg/kg VitD₃体内染毒:卵巢切碎组织P₄和E₂分泌明显降低,与对照组比较,差别有统计学意义（p＜0.05）4.3.6mg/Kg剂量组子宫内膜下层ER表达阳性率显著高于对照组（p＜0.05）;0.0167mg/kg、3.6mg/kg剂量组卵巢皮质ER表达阳性率低于对照组,而0.1mg/kg剂量组卵巢皮质ER表达阳性率高于对照组,差别均有统计学意义（p＜0.01）。四、维生素D₃的雌性性腺毒性的机制（二）（诱导大鼠卵巢细胞凋亡及其可能机制）目的:研究VitD₃对卵巢细胞凋亡的影响及其可能的机制,进一步探讨VitD₃的雌性性腺毒性机制方法:1.完体动物实验模型同前;采用透射电镜观察卵巢组织超微结构,Tunel法检测卵巢细胞凋亡,比色法检测血清及卵巢组织钙离子水平,Realtime RT-PCR法检测ERα、ERβ、Caspase-3、Caspase-8mRNA的表达;2.卵巢颗粒细胞（GC）培养同前;采用FCM测定GC凋亡结果:1.3.6 mg/kg剂量组闭锁卵泡及黄体颗粒细胞凋亡率显著高于对照组（p＜0.01）,而生长卵泡、成熟卵泡各剂量组比较,差别均无统计学意义。2.对照组及各剂量组皆可见凋亡的细胞,与对照组组比较,3.6mg/kg剂量组异染色质增多,成块状,染色质边集,可见明显的凋亡小体,线粒体出现水肿,基质变稀,电子密度明显下降,甚至空泡状;3.3.6mg/kg剂量组卵巢组织钙离子浓度高于对照组（p＜0.05）。4.各染毒剂量组ERα、ERβmRNA表达及ERα/ERβmRNA比值与对照组比较差别无统计学意义（p＞0.05）。5.0.0167 mg/kg剂量组Caspase3mRNA表达显著低于对照组（p＜0.05）,随着染毒剂量增高,各染毒剂量组Caspase3、Caspase8mRNA表达有增加的趋势,而3.6 mg/kg剂量组Caspase3、Caspase8mRNA表达较对照组增高,其中,Caspase8mRNA表达显著高于对照组比较（p＜0.01）。6.体外试验结果显示,10^-7和10^-4 mol/L的维生素D₃可以增加GC的凋亡率,且随着培养时间的延长,凋亡率有增加的趋势。结论:在本实验条件下,可得出如下结论:1.维生素D₃具有子宫营养作用,表现为子宫细胞增殖及腺体数量增多,但其作用弱于雌二醇;2.维生素D₃（亚慢性暴露）具有明显的雌性性腺毒性,可表现为动情间期延长,闭锁卵泡增多,血清性激素改变。3.卵巢是维生素D₃的重要靶器官,维生素D₃可明显抑制卵巢性激素的分泌,还可以影响卵巢及子宫ER的表达,这可能是其雌性腺毒性的重要毒理学基础和可能毒性机制之一;4.维生素D₃可诱导卵巢细胞凋亡:主要是通过导致细胞钙稳态失调;激活caspase家族途径,但具体机制有待进一步探讨。