目的定量分析正常脑组织和不同级别脑胶质瘤细胞核的图像分析参数及增殖指标Ki-67、CyclinD1的表达分数参数,揭示不同级别胶质瘤细胞形态及密度的差异,筛选对胶质瘤分级诊断有价值的参数。通过线性判别函数建立多个胶质瘤分级诊断模型并比较各诊断模型的回代判别准确率,探讨这些参数在脑胶质瘤分级诊断方面的意义,为胶质瘤组织学分级提供客观的方法。材料与方法1.实验材料和分组:收集2010年-2015年广东同江医院手术切除大脑胶质瘤存档病理标本共80例,所有病例均为初治患者,术前未行辅助放、化疗。根据2016年WHO中枢神经系统肿瘤分类的组织学分级标准进行病理学诊断,按照病例的构成,将研究对象分为对照组及病变组,对照组为正常脑组织,收集因脑外伤等手术送检正常脑组织10例。病变组包括WHO Ⅰ-Ⅳ级胶质瘤组,其中Ⅰ级胶质瘤15例,Ⅱ级20例,Ⅲ级25例,Ⅳ级20例;2.实验方法(1)采用光学显微镜、显微摄像仪和图像分析软件进行数据采集和图像分析。首先使用物镜测微尺对测试软件进行标定,再将HE切片置于光学显微镜40倍物镜下随机捕获观察视野,每例取1-4个视野经显微摄像系统采集图像并输入计算机。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分别测试正常脑组织及不同级别胶质瘤细胞核的形态参数。包括:细胞核面积、细胞核长轴与短轴、细胞核周长。计数40倍物镜下细胞的数目及图像视野的面积,计算图片中细胞面数密度和细胞核面积密度。(2)采用免疫组织化学方法分别检测WHO Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅱ级胶质瘤及正常脑组织中增殖指标Ki-67、CyclinD1的表达情况。所有标本经常规脱水、包埋、切片、脱腊后,采用免疫组化方法检测Ki-67、CyclinD1。以胶质瘤细胞胞核出现棕黄色颗粒为阳性,结果观察采用半定量12分法,测试并记录表达分数。所有标本免疫组化染色时均设立阳性对照和阴性对照。免疫组化染色结果由两位有经验的临床病理医师在未知诊断结果的情况下独立阅片判断。(3)采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析,连续型变量的结果以均数(x)、标准差(SD)、最大值(Max)、最小值(Min)，所有测试数值以均数±标准差(x±SD)表示。对不同组间的测试结果进行多组独立样本的秩和检验;计数资料的比较采用卡方检验,以P<0.05为差异有统计学意义。对不同模型组别间进行逐步判别分析并分别建立Fisher线性判别函数,绘制判别函数分类图并计算各模型组的回代判别准确率。结果1.不同级别胶质瘤细胞核形态参数的差异Ⅰ-Ⅳ级胶质瘤细胞核的形态参数显示了核的面积、长轴、短轴和周长整体比较差异有统计学意义,Ⅳ级胶质瘤的上述形态参数平均值均为所有级别中最大,而其标准差为所有级别胶质瘤中最小；WHO Ⅰ级胶质瘤的上述形态参数(除长轴)平均值均为所有级别胶质瘤中最小,ⅡⅠ级胶质瘤的上述形态参数标准差为所有胶质瘤中最大。低级别胶质瘤(WHO Ⅰ-Ⅱ级)不论细胞核面积还是周长均明显低于高级别胶质瘤(WHOⅢ-Ⅳ级),除WHOⅠ级和Ⅱ级瘤细胞核长轴无统计学显著性差异外,其余各组两两比较均具有统计学意义(P值均小于0.05),提示低级别胶质瘤具有较小的细胞核,这是鉴别不同组织学级别的一个重要指标。另一特点是胶质瘤细胞核形态参数的变异程度有所不同,低级别胶质瘤核参数变异度(标准差)较小,高级别肿瘤,特别是WHO Ⅲ级肿瘤变异度较大,提示高级别肿瘤核的大小极不均一,这可能是瘤细胞多形性导致的因素。2.不同级别胶质瘤细胞密度参数的差异尽管不同级别胶质瘤的细胞面数密度存在总体显著性差异(P<0.001),但WHOⅡ级与Ⅲ级之间,以及高级别胶质瘤(Ⅲ-Ⅳ级胶质瘤)之间却均无组间差异,提示WHO Ⅰ级胶质瘤的细胞面数密度最小,但Ⅱ-Ⅳ级胶质瘤细胞密度并无明显变化。不同级别胶质瘤细胞的核面积密度也存在总体显著性差异P<0.001),且各级别之间也存在显著性差异,提示尽管细胞面数密度差别不大,但细胞核面积密度可作为鉴别不同组织级别的胶质瘤的重要图像分析参数。3.正常脑组织与胶质瘤细胞核形态参数及密度参数的差异正常脑组织与WHO Ⅰ级胶质瘤细胞核的参数比较中,除核的长轴有显著的差异(P<0.01)，其余在核的面积、短轴及周长方面,无显著性的差异。而正常脑组织与Ⅱ-Ⅳ级胶质瘤在细胞核的面积、长轴、短轴及周长等参数的比较中,显示明显的统计学差异(P<0.01),提示Ⅱ-Ⅳ级胶质瘤细胞核比正常脑组织细胞核显著增大;在细胞面数密度及核面积密度方面,正常脑组织与Ⅰ级胶质瘤比较无明显差异,而与Ⅱ-Ⅳ级胶质瘤存在显著的统计学差异。提示正常脑组织细胞核形态及单位面积中的细胞密度与Ⅰ级胶质瘤相近,而与Ⅱ-Ⅳ级胶质瘤差异性较大。4.Ki-67在正常脑组织及不同级别胶质瘤中的表达情况Ki-67在10例正常脑组织中均不表达;而Ki-67在80例胶质瘤的阳性率为67.50%(54/80),远高于正常脑组织的表达(P<0.01)。Ki-67在不同级别胶质瘤的表达情况不一致,Ki-67在Ⅳ级胶质瘤的表达分数最高,在Ⅰ级胶质瘤的表达分数最低;Ki-67的表达分数与Ⅰ-Ⅳ级胶质瘤的Spearman等级相关系数为0.703(P<0.001),显示随着Ⅰ-Ⅳ级胶质瘤级别的升高,Ki-67表达的指数分数也逐渐升高。在分组的两两比较中,低级别胶质瘤(I、Ⅱ级胶质瘤)与高级别胶质瘤(Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤)中Ki-67的表达差异有显著的统计学意义(P<0.01);Ki-67在Ⅰ级与Ⅱ级胶质瘤中的表达有增高的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05),与在ⅡⅠ级与Ⅳ级胶质瘤中的表达类似。在临床病理参数中,Ki-67在不同年龄的表达差异有统计学意义(P<0.05),在不同性别、肿瘤大小及部位中表达差异无统计学意义(P>0.05);5.CyclinD1在正常脑组织及不同级别胶质瘤中的表达情况CyclinD1在正常脑组织及不同级别的胶质瘤中的表达不一致,CyclinD1在正常脑组织中仅有1例表达阳性(1/10),而在胶质瘤中的表达阳性率高达83.75%(67/80),具有显著统计学差异。CyclinDl在Ⅰ级胶质瘤的表达分数最低,在Ⅳ级胶质瘤的表达分数最高；CyclinDl的表达分数与Ⅰ-Ⅳ级胶质瘤的Spearman等级相关系数为0.616(P<0.001),显示随着胶质瘤级别的升高,CyclinDl的表达率逐渐升高,染色的强度逐渐增强,而且在表达率的分组两两比较中,Ⅰ-Ⅳ级胶质瘤的差异均有统计学意义(P<0.05)。CyclinD1的表达在不同性别、年龄、肿瘤大小及部位中差异无统计学意义(P>0.05)。6.胶质瘤中Ki-67、CyclinDl表达的相关性分析Pearson相关检验显示Ki-67、CyclinD1两种蛋白在胶质瘤中的表达存在显著相关,提示两者之间呈显著正相关关系(R=0.816，X2=19.218,P<0.01)。7.基于图像分析参数及增殖指标表达分数参数的多种胶质瘤分级诊断模型(1)以正常脑组织、不同级别胶质瘤的形态参数及密度参数为基础参数,加入Ki-67及CyclinD1的表达分数进行Fisher线性判别分析,通过建立线性判别函数获得正常脑组织与四级胶质瘤分类中四级胶质瘤图像分析诊断模型、四级胶质瘤图像分析+ Ki-67诊断模型、四级胶质瘤图像分析+ CyclinD1诊断模型及四级胶质瘤图像分析+ Ki-67、CyclinD1诊断模型四个模型,计算回代判别准确率分别为76.7%、75.6%、78.9%及78.9%。将各诊断模型回代判别总准确率进行分组两两比较,结果显示均无统计学差异(P值均大于0.05)。(2)整合低级别胶质瘤(Ⅰ-Ⅱ级胶质瘤)及高级别胶质瘤(Ⅲ-Ⅳ级胶质瘤)的图像分析参数(形态参数及密度参数),加上正常脑组织的图像分析参数(形态参数及密度参数)进行Fisher线性判别分析,通过建立线性判别函数获得高低级别胶质瘤图像分析诊断模型,计算回代判别准确率为88.9%。结论1.胶质瘤细胞核的图像分析中的面积、长轴、短轴及周长等形态参数和单位面积中的细胞数量及核面积密度可作为胶质瘤组织学定量分级诊断的重要指标参数,对脑胶质瘤诊断分级具有重要意义。2.增殖指标Ki-67及CyclinD1表达分数随着胶质瘤级别的增高而增高,两者联合应用在胶质瘤的病理分级诊断及预后分析具有较强的客观性及实用价值。3.基于图像分析中的核面积、核长轴、核短轴和单位面积中的细胞数量及细胞核面积、Ki-67及CyclinD1表达分数建立胶质瘤分级诊断模型,回代判别准确率相近(两两比较无统计学差异),可达78.9%。4.基于胶质瘤细胞的核面积、核长轴、核短轴及核周长和单位面积的细胞数量及核面积密度,建立高低级别胶质瘤分级诊断模型,准确率可达88.9%。