基于核酸适配体和量子点的急性淋巴白血病细胞检测研究

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急性淋巴白血病是一种恶性血液病,在人群癌症发病率中有着较高的比例,特别是在儿童及青少年白血病发病率中占有75%以上比例,严重威胁着人类的生命健康安全。近年来,核酸适配体作为“化学抗体”的出现,为急性淋巴白血病诊断分型技术的发展带来了新的契机,其不仅具有类似生物抗体对靶标高特异性和高亲和力的特性,还表现出修饰简单、靶目标物丰富、易于合成等诸多优点,从而提供了一种理想的肿瘤靶向识别分子。与此同时,随着纳米技术的发展,一种新型纳米荧光材料——量子点由于具有吸收光谱宽、发射光谱窄、荧光强度高、光稳定性好、发射光谱可调等优越特性,在体内外肿瘤检测和成像相关研究中受到了重要关注,为建立基于新型信号放大效应的肿瘤诊断技术提供了可能。基于此,本论文以发展新型急性淋巴白血病细胞检测方法为目标,通过结合核酸适配体作为新型肿瘤靶向识别分子的优势和量子点作为新型荧光标记物的优秀光学性质,构建了两类新型肿瘤细胞检测探针,并结合流式细胞术等开展了CCRF-CEM细胞的高特异、高灵敏检测分析研究。具体包括以下两个部分:一、核酸适配体功能化的量子点荧光探针用于CCRF-CEM细胞的检测研究为克服单纯荧光染料标记核酸适配体在应用于急性淋巴白血病细胞检测时所存在的信号强度低、灵敏度有限、光稳定性不足等缺点,利用近红外荧光量子点作为新型标记物所具备的荧光强度高、光稳定性好、在复杂生物体系中自发背景干扰小等优秀光学性质,以CCRF-CEM细胞为靶目标,选择其特异性核酸适配体sgc8c作为靶向识别分子,通过“链霉亲和素-生物素”特异性结合作用,将生物素化sgc8c修饰到链霉亲和素包被的量子点表面,成功构建了一种新型的CCRF-CEM细胞靶向检测荧光探针。经琼脂糖电泳、紫外-可见吸光光度计及荧光分光光度计等系统表征发现,以10:1的摩尔比将核酸适配体与量子点作用时,绝大多数核酸适配体可成功连接于量子点表面,并不会对其荧光性质产生明显影响。进一步利用流式细胞术,在对该探针用于CCRF-CEM细胞检测的实验条件进行优化基础上,成功实现了缓冲液及小鼠血清中CCRF-CEM靶细胞的特异性检测分析。在相同条件下与传统荧光染料标记探针相比,该核酸适配体功能化的量子点荧光探针对CCRF-CEM细胞的检测灵敏度提高了约7倍,有望提供一种高灵敏、高特异性的人急性淋巴白血病细胞诊断方法。二、基于量子点荧光共振能量转移(FRET)效应的裂开型核酸适配体探针用于CCRF-CEM细胞的检测研究为解决上述“always on”模式探针在应用于肿瘤细胞检测时仍然存在的背景信号较高、对比度有限等不足,以CCRF-CEM细胞为靶目标,通过将其特异性核酸适配体sgc8c分裂为两段并分别标记荧光供体和荧光受体,基于靶细胞可诱导上述两段裂开片段形成特定识别构型拉近荧光供受体对进而导致FRET效应的原理,成功构建了一种新型的CCRF-CEM细胞激活式检测荧光探针。首先采用Cy3-Cy5作为荧光供受体对对该探针的裂开位点、探针比例、浓度反应时间、缓冲液体系以及染料标记位置等进行了系统优化,结果表明sgc8c-3a和sgc8c-2b的核酸片段组合在比例为1:8、sgc8c-3a浓度为40nM、反应时间为90min、染料标记位置为裂开位点处以及培育体系为结合缓冲液等条件下,显示出了对靶肿瘤细胞的高亲和力和最佳FRET信号激活性能。在此基础上,进一步采用量子点替换Cy3作为荧光供体构建了基于量子点-Cy5FRET效应的裂开型核酸适配体探针。采用Ramos细胞作为阴性对照,经流式细胞术考察发现,该探针虽然可有效保持对CCRF-CEM细胞的高亲和力,但可能由于量子点存在较大空间位阻等原因导致FRET激活信号较弱,仍有待改进。
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