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近年来，随着大菱鲆养殖规模的扩大、地下水资源短缺、疾病困扰以及养殖装备技术的改进，大菱鲆工厂化养殖模式逐渐从传统流水养殖模式向封闭循环水养殖模式发展。循环水养殖模式具有资源节约、污染低、产品安全等优点。在水产养殖中，高养殖密度是循环水养殖模式的主要优势之一。然而循环水系统中大菱鲆适宜的放养密度是多少？循环水系统是否适合大菱鲆高密度养殖？过高的养殖密度如何影响大菱鲆生长与生理状况？这些均是目前大菱鲆养殖研究中亟待解决的问题。因此在循环水系统中综合评价养殖密度对大菱鲆的影响具有重要的意义。 在集约化的水产养殖中，尤其是循环水养殖系统中，由于养殖密度的提高、过量的投喂、不当的操作、硝化细菌的失衡等因素，通常会引起氨氮和亚硝酸盐在水体中积累或短暂的升高，对养殖鱼类产生不利的影响。然而在大菱鲆中，关于氨氮和亚硝酸盐胁迫的报道较少，且其毒性机制尚不明确。因此研究氨氮和亚硝酸盐对大菱鲆毒性作用具有十分重要的意义。本研究以大菱鲆为对象，首先探究了循环水系统中养殖密度对其生长和生理状况的影响，并结合生化指标和分子指标综合分析其响应机制;其次评估了亚硝酸盐和氨氮的胁迫作用，从应激、凋亡、免疫等多方面分析其响应机制。主要研究内容和结果如下: 1.循环水系统中养殖密度对大菱鲆水质、生长与血液生理参数的影响 本研究分三个阶段，每个阶段设低、中、高三个养殖密度。养殖过程中连续监测水质因子、生长参数和血液生理参数，并应用主成分分析法(PCA)综合评估养殖密度对大菱鲆的影响。水质数据显示:在三个养殖阶段后期，高密度组总氨氮(TAN)和化学需氧量(COD)含量显著高于低密度组(P＜0.05)。生长数据显示:三个养殖阶段末，高密度组大菱鲆体重、体长、绝对生长率(AGR)、特定生长率(SGR)显著低于低密度组（P＜0.05）;饵料系数(FCR)和体重差异系数(Coefficient of variation for weight，CVw)显著高于低密度组（P＜0.05）;但成活率、肥满度(K)和鳍指数没有明显变化。血液生理数据显示:三个养殖阶段末，与低密度组相比，高密度引起大菱鲆血浆葡萄糖、皮质醇、乳酸、胆固醇和甘油三脂含量的显著升高(P＜0.05)。PCA分析显示:在三个养殖阶段末，高密度组与低密度、中密度组均无交叉，被显著分为两类，而低密度和中密度组因子得分值相近，表明养殖密度越高，对大菱鲆生长和生理状态越不利。此外结果还显示:在本研究条件下，70 g左右的大菱鲆养殖密度不宜超过14.3 kg/m2;180 g左右的大菱鲆养殖密度不宜超过25.7 kg/m2;510 g左右的大菱鲆养殖密度不宜超过52.3 kg/m2。 2.循环水系统中养殖密度对大菱鲆渗透压、抗氧化状态和代谢能力的影响 通过检测血液中渗透压，血液、肝、鳃和皮肤组织中抗氧化状态，肝、鳃组织中代谢酶活力评估大菱鲆对高养殖密度胁迫的生理响应。渗透压数据显示:高养殖密度显著提高了血液中氯离子(C1-)和渗透压水平(P＜0.05);同时鳃组织中Na+-K+ ATP酶活力及基因表达也显著升高(P＜0.05);但对钠离子(Na+)和钾离子(K+)浓度没有影响。抗氧化参数显示:养殖120天后，大菱鲆血浆、鳃、皮肤和肝脏中过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽(GSH)水平在高密度组显著降低(P＜0.05)，丙二醛(MDA)含量显著升高（P＜0.05）。代谢参数显示:在肝组织中，甘油-3-磷酸脱氢酶(G3PHD)和果糖-6-磷酸脱氢酶（G6PHD）在高密度组中显著降低（P＜0.05），但果糖-1，6-二磷酸酶(FBPase)和己糖激酶(HK)未受养殖密度的影响;在鳃组织中，四种代谢酶均未受养殖密度的影响。以上结果表明高养殖密度改变了大菱鲆渗透压水平、引起氧化应激并影响肝脏中脂肪和糖代谢能力。 3.循环水系统中养殖密度对大菱鲆应激反应与免疫能力的影响 通过检测血液、粘液、肝、肾和皮肤中应激与免疫相关蛋白含量以及基因表达评估养殖密度对大菱鲆应激反应与免疫能力的影响。结果显示:养殖120天后，血浆中，高密度引起皮质醇含量显著升高，免疫球蛋白M(IgM)、补体3(C3)和溶菌酶(LZM)降低(P＜0.05);粘液中，LZM、碱性磷酸酶(ALP)和酯酶活力在高密度组显著降低(P＜0.05)。基因表达分析显示:高密度引起肝、肾和皮肤中的热休克蛋白70(HSP70)、金属硫蛋白(MT)和细胞色素酶P450(CYP1A)基因表达上调（P＜0.05）;LZM、铁调素(HAMP)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素(IL-1β)基因表达下调(P＜0.05)。以上结果显示过高养殖密度引起了细胞内应激反应，同时降低了机体免疫能力。 4.大菱鲆对亚硝酸盐胁迫的应激响应 从生理指标、氧化应激、凋亡、免疫等方面评估大菱鲆对亚硝酸盐胁迫的响应机制。血液生理数据显示:高浓度的亚硝酸盐(0.4和0.8 mM)暴露48 h后，高铁血红蛋白(MetHb)，甘油三酯(TG)、K+、皮质醇、HSP70、葡萄糖、谷丙转氨酶(GOT)、谷草转氨酶(GOT)、ALP、C3和C4显著升高(P＜0.05);而Hb、Na+、IgM、LZM显著降低(P＜0.05)。鳃组织数据显示:暴露48 h或96 h后，高浓度的亚硝酸盐显著降低了抗氧化物酶(SOD、谷胱甘肽氧化酶GPx、CAT)活力，消耗了GSH含量（P＜0.05），促进了MDA形成（P＜0.05）;上调了凋亡相关基因(c-jun氨基末端激酶JUK1、p53、caspase-3、caspase-7和caspase-9)、应激与炎症相关基因(HSP70、HSP90、MT、Toll样受体TLR-3、TNF-α和IL-1β)（P＜0.05）的表达;下调了LZM和类胰岛素生长因子(IGF-1)基因表达(P＜0.05)。结果表明高浓度亚硝酸盐扰乱大菱鲆生理功能、诱导氧化应激和脂质过氧化、引起细胞内应激反应、介导TLR-3表达导致炎症反应和免疫力降低;同时还诱导鳃组织中细胞凋亡的发生。 5.大菱鲆对氨氮胁迫的应激响应 本研究评估了氨氮急性胁迫对大菱鲆生理应激反应、抗氧化状态与免疫能力的影响。结果显示:高浓度的氨氮(TAN)暴露48 h后，血浆中促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质醇含量显著升高(P＜0.05)，生长激素(GH)、C3、C4、IgM和LZM含量显著下降（P＜0.05）;肝脏中SOD和CAT活力、MDA形成、HSP70和HSP90基因表达显著升高(P＜0.05)，但IGF-1基因表达显著下降(P＜0.05)。以上结果表明高浓度氨氮暴露激活HPI轴、诱导氧化应激、抑制GH/IGF-1轴和免疫能力。