视网膜变性(retina degeneration, RD)是一类严重的致盲性眼病,主要症状表现为夜盲及视野变窄等[21-23]。RD具有家族遗传特性,进展缓慢且不可逆,其主要病理改变为:视网膜感光细胞发生进行性变性及死亡,继而视网膜内层相关细胞出现继发性萎缩,同时伴随大量神经胶质细胞增生[24, 25]。目前,RD患者数量正呈现出逐年递增的趋势。针对RD的发病机制、临床治疗等问题已经进行广泛的研究并取得了突破性进展,但目前仍然缺乏有效的治疗方法以终止和恢复变性视网膜的功能。rd1小鼠是一类快速视网膜感光细胞变性(rapid retinal degeneration)动物模型,主要是由于磷酸二酯酶β亚基(βsubunit of phosphodiesterase, Pde6β)基因发生突变导致了环鸟苷酸(cycle guanosine monophosphate, cGMP)不能转变成鸟苷酸(guanosine monophosphate, GMP),视网膜光传导因此被阻断,最终导致感光细胞的死亡[2, 26]。因rd1小鼠基因突变与人类致病原因具有同源性,该小鼠常被用作视网膜变性疾病的动物模型。在视网膜变性过程中,小胶质细胞发挥了保护或加重视网膜损伤的“双刃剑”作用。随着视网膜变性的发展,小胶质细胞由生理状态下的静息状态转变为病理状态的激活状态,形态从树枝状转为阿米巴样,并由内丛状层逐步向感光细胞变性的外核层迁移以发挥细胞免疫作用[3]。此外,小胶质细胞被激活后,还可分泌肿瘤坏死因子(tumornecrosis factor,TNF-α)、一氧化氮(nitric oxide, NO)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)多种炎症因子及反应性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)等,引发炎症损伤反应,因而加速视网膜变性进程[4]。有研究证明,免疫抑制剂米诺环素抑制视网膜内小胶质细胞的活化后可降低感光细胞的凋亡率,延缓视网膜变性进程[4]。近年来,干细胞移植治疗视网膜变性类疾病已经从实验室研究走向临床应用。目前,用于治疗视网膜变性的干细胞主要包括:骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSC),胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)及神经干细胞(neural stem cells, NSCs)等[8,10, 19, 27-29]。神经干细胞在发育学上与眼组织来源于同一胚层,更易向眼部细胞分化,且成瘤风险低。本实验室前期工作已成功转染绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)入神经干细胞株(C17.2),该细胞株性质稳定且自带绿色荧光示踪,是用于移植的良好种子细胞[11]。干细胞移植治疗视网膜变性疾病的作用机制十分复杂。目前认为,干细胞治疗的早期效应可能来自移植细胞的神经营养效应及保护作用,即By-stander效应[30-35]。而长期效应则可能来自于移植细胞对变性视网膜细胞的替代作用,即Cell replacement效应[36]。近来有研究表明,干细胞移植后还可以产生免疫调控作用,使受体内免疫环境发生改变,进而影响病程进展[37, 38]。那么,神经干细胞移植入变性视网膜下腔后对视网膜免疫环境产生何种影响?哪种机制、哪些分子参与了干细胞的免疫调控作用?目前尚未见报道,这都是本研究需要探索和解决的问题。基于前期本实验室研究基础及以上研究现状,我们提出如下假设:rd1小鼠视网膜变性进程中,小胶质细胞发生活化,产生促炎作用加速视网膜变性。将神经干细胞移植入视网膜下腔后,可以通过神经干细胞的免疫调控作用抑制小胶质细胞活化,从而保护感光细胞,延缓视网膜变性进程。本研究包括三个部分:第一部分:rd1小鼠视网膜变性过程中感光细胞凋亡及小胶质细胞激活特点的研究采用rd1小鼠快速视网膜变性动物模型,以C57小鼠作为对照,通过视网膜免疫荧光染色、TUNEL细胞凋亡染色技术观察到,与同龄的对照组小鼠相比,在rd1小鼠变性视网膜中,感光细胞逐步发生凋亡且随病变进展急剧增加,于P14d达到峰值,最终随外核层细胞的减少而逐步减少。同时,rd1小鼠视网膜中的小胶质细胞随病变进展逐步由树枝样静息状态转变为阿米巴样活化状态,并由内丛状层向外核层发生迁移,随后于变性中晚期回退,迁移的方向与凋亡的感光细胞所在部位一致。另外,Western-blot技术发现,由凋亡感光细胞表达的趋化因子Fractalkine在视网膜变性早期相对稳定,于变性中晚期稍有上升随后小幅回落;其表达于小胶质细胞的相应受体CX3CR1自变性中期开始迅速上升,变性晚期稍有下降趋势。提示变性视网膜中小胶质细胞向外核层的迁移可能与Fractalkine/CX3CR1的变化有关。第二部分:神经干细胞视网膜下腔移植对rd1小鼠感光细胞层的保护作用及其对小胶质细胞的调控作用研究经鉴定,本实验室建立的GFP-C17.2-NSC细胞约75%带有绿色荧光,移植后能够示踪,是用于视网膜下腔移植的良好种子细胞。随后,将GFP-C17.2-NSC细胞注射入rd1小鼠视网膜下腔,以PBS注射为阴性对照组,行TUNEL细胞凋亡染色发现,GFP-C17.2-NSC细胞移植组rd1小鼠视网膜内感光细胞凋亡率较对照组明显减少,外核层厚度降低速度明显减缓;同时,GFP-C17.2-NSC细胞移植导致rd1小鼠视网膜中小胶质细胞激活过程(包括增殖、形态变换及迁移)被抑制。提示神经干细胞移植能够抑制变性视网膜中小胶质细胞的激活并减少感光细胞凋亡,从而延缓视网膜变性进程。第三部分:神经干细胞对小胶质细胞调控作用的机制研究为了研究神经干细胞对小胶质细胞调控作用的机制,我们首先以LPS预处理小胶质细胞4小时以激活小胶质细胞,再采用Transwell小室,建立了体外共培养模型:将神经干细胞培养于Transwell上层,小胶质细胞培养于底层为实验组;以单独小胶质细胞培养为空白对照组;以3T3细胞共培养作为阴性对照组,体外共培养观察时间为12h、24h、48h。研究发现,与神经干细胞共培养12h后,小胶质细胞增殖能力显著下降,而凋亡率显著上升。流式检测也证实,与神经干细胞共培养的小胶质细胞增殖指数较空白对照组、阴性对照组明显降低。另外,RT-qPCR、ELISA检测发现,与神经干细胞共培养的小胶质细胞TNF-α、IL-1β的表达量及蛋白水平较空白对照组及阴性对照组均显著下降,提示神经干细胞可抑制小胶质细胞的炎症反应。为了探讨神经干细胞与小胶质细胞间“对话”的机制,本研究利用RT-qPCR、ELISA两种方法检测了神经干细胞/小胶质细胞共培养上清中相关细胞因子的表达。结果发现,在Transwell体系中与神经干细胞共培养后,神经干细胞细胞因子TIMP1的表达量明显上升,而由小胶质细胞分泌的相应靶点分子MMP9的表达量则逐步下调,提示TIMP1与MMP9可能是神经干细胞与小胶质细胞间沟通的信号通路。根据以上实验结果,本研究得出以下结论:1. rd1小鼠视网膜中小胶质细胞自变性早期开始出现活化反应:由内丛状层逐渐向外核层迁移,并由树枝样静息状态逐渐转变为阿米巴样激活状态;在变性中期外核层中小胶质细胞的激活达到峰值而在变性中晚期激活开始下降。变性视网膜中小胶质细胞的变化趋势与感光细胞凋亡趋势几乎一致,提示在rd1小鼠视网膜变性过程中,小胶质细胞的激活参与了视网膜的变性进程。2.变性视网膜中凋亡的感光细胞可能分泌Fractalkine以引导表达其受体CX3CR1的小胶质细胞向外核层的定向迁移。3.在rd1小鼠视网膜变性早期移植入GFP-C17.2-NSC细胞后,视网膜中小胶质细胞的激活被显著抑制。同时,GFP-C17.2-NSC细胞移植导致rd1小鼠感光细胞凋亡率减少,外核层厚度降低速度延缓,提示植入的神经干细胞能发挥免疫调控作用,抑制视网膜小胶质细胞活化,保护外核层感光细胞,延缓视网膜变性进程。4.体外共培养时,神经干细胞对小胶质细胞具有重要影响:不仅可以使小胶质细胞增殖能力降低、细胞凋亡水平上升、细胞周期学增殖指数(PI)降低,还可抑制小胶质细胞炎症因子TNF-α、IL-1β的分泌能力;5.神经干细胞可能通过分泌细胞因子TIMP1靶向削减小胶质细胞分泌的细胞因子MMP9表达量。