1993年,Victor Ambros和Gary Ruvkun的研究团队几乎同时发现并确认了一类新的小分子RNA——即微小RNA(micro RNA;mi RNA),开启了微小RNA研究纪元。微小RNA是由大约22至24个核苷酸组成的,在进化上十分保守的短链非编码RNA,通过转录后调控的方式实现其调节基因表达的功能。目前认为微小RNA受到细胞类型和分化阶段的严格调控,并在特定的组织和特定的阶段表达。微小RNA表达的组织特异性和时序性显示了它们对组织和细胞功能特异性的决定作用及在细胞生长和发育过程中多种重要调节作用。既往研究发现绝大多数肿瘤都存在micro RNA表达失调,这些异常表达的micro RNA可参与肿瘤的发生、增殖、侵袭、转移等多个阶段/多个方面。许多micro RNA已被确定作为癌基因、肿瘤抑制基因和细胞信号通路中的重要调节因子。micro RNA的致癌或肿瘤抑制功能依赖于其靶基因的作用。癌基因作用的micro RNA活性增加导致肿瘤抑制基因活性受抑制,同时促进细胞增殖以及肿瘤进展。肿瘤抑制基因作用的micro RNA的活性下降导致癌基因翻译增加,促进肿瘤的形成。在全世界范围内,胃癌在亚洲高发,而欧美发达国家发病率相对较低。胃癌在肿瘤中排名第四,并是第二大致死性肿瘤疾病。每年约有100万的胃癌新增病例。胃癌的发病是一个受遗传、环境、饮食、生活习惯等多因素的影响的复杂过程,其确切机制仍需要更加深入的探索。微小RNA发现及相关研究的进展,使我们探讨胃癌的发生、发展过程多了一条新的途径。多个微小RNA(mi RNA;mi R),如mi R-9、mi R-421、mi R-27a、mi R-143、mi R-145、mi R-29及mi R-101等,已被证实在胃癌中发挥重要的调控作用。并可通过调控细胞增殖、凋亡、侵袭和转移能力的改变而参与胃癌的发生发展,其表达水平变化的联合检测,有望成为胃癌早期诊断、预后评估的重要标记分子,并可能成为胃癌治疗的新靶点。在细胞增殖、细胞凋亡、侵袭和转移等方面,多个mi RNAs在胃癌中在多个方面产生作用。例如,mi R-199a可以影响胃癌细胞的增殖、凋亡和转移功能,mi R-301a和mi R-1303均能在细胞增殖、细胞凋亡、侵袭和转移四个方面调节胃癌的发生和发展。Ueda等通过较大样本临床标本通过芯片筛选后发现,在胃癌组织中micro RNA-425-5p表达水平显著高于癌旁正常胃粘膜组织。作为最为常见恶性肿瘤之一的胃癌,micro RNA-425-5p在既往研究中表达失调,存在参与胃癌发生、发展的可能性。目前在肿瘤、尤其是胃癌中还未见micro RNA-425-5p相关研究。本研究目的在于探讨micro RNA-425-5p在胃癌细胞中的表达改变及其对胃癌发生发展的影响,以期为胃癌的发病机制研究开辟新的领域,为micro RNA-425-5p在胃癌的早期诊断以及预后评估和治疗等方面实践和应用,提供理论依据。本系列研究基于以上问题,在胃癌方面进行下列研究:应用Taqman探针法对胃癌上皮细胞株SGC-7901、MKN-28、MKN-45、BGC-823、AGS,和胃粘膜正常细胞株GES-1中的micro RNA-425-5p表达水平进行检测,评估micro RNA-425-5p的表达差异是否存在显著性。如果胃癌上皮细胞株和GES-1存在micro RNA-425-5p的表达显著性差异,则选取特定胃癌上皮细胞株作为进一步研究对象。在细胞水平,通过上调和下调micro RNA-425-5p表达水平观察其对胃癌细胞在增殖、细胞周期、侵袭、转移等方面的影响。而后在细胞学基础上,建立移植瘤动物模型,进一步在体内证实其作用机制。初步揭示micro RNA-425-5p的异常表达与胃癌的发生、发展存在的关联,以及在临床应用中的潜在价值。本课题三部分的具体内容如下:第一部分micro RNA-425-5p在胃癌细胞中的表达目的:选取胃癌上皮细胞株:SGC-7901、MKN-28、MKN-45、BGC-823、AGS和胃粘膜正常细胞株GES-1,评估micro RNA-425-5p在胃癌上皮细胞株与GES-1中的表达差异。方法:培养至最佳状态的胃癌上皮细胞株:SGC-7901、MKN-28、MKN-45、BGC-823、AGS和胃粘膜正常细胞株GES-1的总RNA应用TRIzol®试剂提取。应用Taq Man Micro RNA Assay和Taq Man Universal PCR Master Mix,对细胞的micro RNA-425-5p表达水平进行q RT-PCR检测,比较micro RNA-425-5p在不同细胞株中的表达差异。结果:胃癌上皮细胞株micro RNA-425-5p较正常胃粘膜细胞GES-1的micro RNA-425-5p表达水平明显升高,其中以MKN-45、SGC-7901、BGC-823升高最为显著。小结:与正常胃粘膜上皮细胞株GES-1比较,胃癌上皮细胞株(SGC-7901、MKN-28、MKN-45、BGC-823、AGS)micro RNA-425-5p的表达水平显著升高。其中以MKN-45、SGC-7901、BGC-823升高最为显著。与既往研究临床样本的检测结果一致。初步揭示了micro RNA-425-5p的异常表达与胃癌的发生、发展存在某种关联,值得进一步在细胞等水平进行进一步研究。第二部分micro RNA-425-5p对胃癌细胞增殖、侵袭和转移的影响目的:观察micro RNA-425-5p表达水平变化对BGC-823细胞在增殖、细胞周期、侵袭、转移等方面的影响。方法:通过应用micro RNA-425-5p的模拟物和抑制剂对胃癌上皮细胞株BGC-823经瞬时转染后调高或调低micro RNA-425-5p在胃癌细胞中的表达水平。应用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力变化;软琼脂集落形成试验评估细胞锚着非依赖性生长能力;通过细胞迁移和侵袭实验评估细胞侵袭和转移能力变化。结果:1与inhibitor NC组和BGC-823空白对照组(简称WT组)比较,转染micro RNA-425-5p inhibitor的BGC-823细胞增殖率显著下降,差异有统计学意义;BGC-823细胞转染micro RNA-425-5p mimics 24h后,细胞增殖率升高,与mimics NC组比较,细胞活力增加,差异有统计学意义。同时由于micro RNA-425-5p表达的增加,细胞锚着非依赖性生长能力增强,高度提示micro RNA-425-5p可能对肿瘤生长起促进作用。2BGC-832细胞转染micro RNA-425-5p inhibitor后,细胞迁移能力较inhibitor NC组和BGC-823空白对照组(简称WT组)显著下降,差异有统计学意义。而BGC-832细胞中转染micro RNA-425-5p mimics后,细胞迁移能力显著高于mimics NC组。实验表明micro RNA-425-5p具有促进胃癌细胞迁移的能力。3细胞侵袭实验发现:micro RNA-425-5p inhibitor转染BGC-832细胞后,细胞侵袭能力较inhibitor NC组和BGC-823空白对照组(简称WT组)显著下降,差异有统计学意义。micro RNA-425-5p mimics转染BGC-832细胞后,细胞侵袭能力较mimics NC组显著增强,差异有统计学意义。实验表明micro RNA-425-5p具有促进胃癌细胞侵袭、转移的能力。小结:1胃癌上皮细胞株BGC-823体外转染micro RNA-425-5p mimics可有效提高micro RNA-425-5p表达水平,与而mimics NC组相比,细胞增殖率升高;而BGC-823细胞转染micro RNA-425-5p inhibitor后,micro RNA-425-5p表达水平降低,细胞增殖率显著下降,提示micro RNA-425-5p可促进胃癌细胞增殖途径参与胃癌的发生发展过程。2软琼脂集落形成实验显示,随着micro RNA-425-5p表达的增加,细胞锚着非依赖性生长能力增强。高度提示micro RNA-425-5p对肿瘤生长起促进作用。3 BGC-823细胞转染micro RNA-425-5p inhibitor,细胞迁移能力显著下降。而BGC-823细胞中转染micro RNA-425-5p mimics后,细胞迁移能力显著增强。实验表明micro RNA-425-5p具有较强的促进胃癌细胞迁移的能力。4经细胞侵袭实验发现:micro RNA-425-5p inhibitor转染BGC-823细胞后,细胞侵袭能力下降。而micro RNA-425-5p mimics转染BGC-823细胞后,细胞侵袭能力显著增强。提示micro RNA-425-5p促进胃癌细胞侵袭。第三部分micro RNA-425-5p对裸鼠肺转移的影响目的:动物实验-裸鼠成瘤实验来进一步评估micro RNA-425-5p对肿瘤侵袭/转移的影响。方法:15~16g 4~5周龄雌性BALB/C裸鼠15只,随机分为3组,每组5只。在无菌操作下,用0.1ml注射器接种0.1ml细胞悬液(约含1x106个/细胞)于裸鼠尾静脉建立移植瘤模型。6周后引颈法处死裸鼠,解剖并取出裸鼠肺组织。经HE染色后在光学显微镜下观察裸鼠肺转移瘤情况,并以组为单位对肺转移瘤计数。结果:与接种转染micro RNA-425-5p inhibitor Negative control的BGC-823细胞组和BGC-823空白对照组(简称WT组)相比,接种转染micro RNA-425-5p inhibitor的BGC-823细胞的裸鼠,肺转移灶数目显著减少,提示lmicro RNA-425-5p inhibitor在肿瘤发展过程中发挥抑制肿瘤侵袭、转移的作用。与细胞学实验结果吻合。小结:裸鼠移植瘤模型实验提示micro RNA-425-5pinhibitor在肿瘤发展过程中发挥抑制肿瘤侵袭、转移的作用。进而说明micro RNA-425-5p调高可以促进肿瘤侵袭和转移;调低micro RNA-425-5p可以抑制肿瘤的侵袭、转移能力。结论1胃癌上皮细胞株(SGC-7901、MKN-28、MKN-45、BGC-823、AGS)micro RNA-425-5p较正常胃粘膜细胞GES-1的micro RNA-425-5p表达水平明显升高,其中以MKN-45、SGC-7901、BGC-823升高最为显著。2 micro RNA-425-5p的调高可以促进胃癌细胞株BGC-823增殖,而调低可以抑制BGC-823的增殖能力。3软琼脂集落形成实验结果表明,micro RNA-425-5p表达的增加,细胞锚着非依赖性生长能力增强,提示micro RNA-425-5p可能对肿瘤生长起促进作用。4 BGC-823细胞转染micro RNA-425-5p inhibitor后,细胞迁移能力显著下降,而BGC-823细胞中转染micro RNA-425-5p mimics后,细胞迁移能力显著高于mimics NC组。实验表明micro RNA-425-5p具有较强的促进胃癌细胞迁移的能力。5 micro RNA-425-5p inhibitor转染BGC-823细胞后,细胞侵袭能力较inhibitor NC组和BGC-823空白对照组(简称WT组)显著下降。micro RNA-425-5p mimics转染BGC-823细胞后,细胞侵袭能力较mimics NC组显著增强。表明micro RNA-425-5p促进胃癌细胞侵袭和转移。6与接种转染micro RNA-425-5p inhibitor Negative control的BGC-823细胞组和BGC-823空白对照组(简称WT组)相比,接种转染micro RNA-425-5p inhibitor的BGC-823细胞的裸鼠,肺转移灶数目显著减少,提示micro RNA-425-5p inhibitor在肿瘤发展过程中发挥抑制肿瘤侵袭、转移的作用。进而说明micro RNA-425-5p调高可以促进肿瘤侵袭和转移;调低micro RNA-425-5p可以抑制肿瘤的侵袭、转移能力。