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多器官功能障碍综合征(Multiple Organ Dysfunction Syndrome，MODS)是烧伤后三大死亡原因之一，业已证实缺血缺氧是导致烧伤各种脏器损害的主要始动因素之一。缺血缺氧导致细胞氧利用及能量代谢障碍，进一步可引发失控性炎症反应，最终广泛损害细胞的功能，导致细胞凋亡或死亡。肠道是对缺血、缺氧损伤最敏感的器官之一，其缺氧性损伤普遍存在于严重烧、创伤后的病理生理过程中，严重烧伤后，由于肠粘膜屏障损害、免疫功能受抑和肠道菌群紊乱，肠道中的微生物和内毒素可通过受损的肠粘膜屏障侵入到体循环及其它脏器，形成肠源性感染。后者可成为导致全身性炎症反应综合征(Systematic Inflammatory Response Syndrome，SIRS)乃至MODS的启动因素。因此，如何减轻烧伤早期肠粘膜损伤，保护肠粘膜屏障功能已成为目前烧、创伤防治研究的重要课题。 热休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSPs)是一组生物体(或离体培养细胞)在应激情况下由热休克基因所编码合成的序列高度保守的伴随细胞蛋白，并能对抗随后更为严重的应激损伤。应激情况下，热休克因子(heat shock factor,HSF)激活，HSF与热休克基因上游的一段DNA序列热休克元件(heat shock element，HSE)结合启动HSPs的转录。几乎所有的细胞均能合成HSPs，其中HSP70是HSPs家族中最保守、含量最丰富，也是研究最广泛的一种。近年来研究发现HSP70作为一种非特异性的细胞内源性保护蛋白，在防止应激引起的细胞损害或者使受损的细胞恢复方面起着重要作用。有研究表明通过诱导HSP70表达增加可增强心、肺、肝等器官对缺血缺氧的拮抗作用，其诱导的数量与保护作用的强弱呈正相关，提示上调器官组织内HSP70的含量有助于其免受或少受缺血缺氧性损伤。 严重烧伤本身及随后出现的缺血缺氧和失控性炎症反应对于机体组织细胞而言均为严重的应激，对于HSP70在严重烧伤后的变化规律及其在烧伤早期脏器损害中的作用目前尚不明确，本课题拟通过烧伤大鼠模型及体外培养肠上皮细胞缺氧复氧模型，研究烧伤后早期肠粘膜组织HSP70表达变化规律，通过上调组织细胞内HSP70的表第三军医大学博士学位论文达，分别从细胞凋亡、线粒体功能变化等方面探讨HSP7O在严重烧伤早期肠粘膜缺血缺氧性损害中的作用及其机制，旨在探讨细胞的内源性保护机制在烧伤早期脏器损害中的作用，为烧伤后缺血缺氧和失控性炎症反应等病理生理过程中细胞和器官的保护提供一个新的思路和可能的应用前景。 一、材料方法: 1.采用大鼠111“30%TBSA烧伤模型，检测伤后3、6、12、24、48h不同时相点肠粘膜组织内HSP7O及 HSFI的表达分布情况。 2.通过亚砷酸钠预处理诱导大鼠肠粘膜HSP70表达增加，检测大鼠m 030%TBSA烧伤后血浆内毒素、二胺氧化酶(Dian五ne oxidase，n^0)、D一乳酸、肠粘膜组织MDA、SOD含量及肠上皮细胞凋亡的变化，烧伤后肠粘膜组织病理学改变及HSP70、Bel一2表达的情况。 3.全长HsP70基因与cosmid质粒pAxCAwt连接构建穿梭质粒。然后与腺病毒DNA一TPC共转染293细胞，通过同源重组成功构建了Ad一HSP70腺病毒重组体，扩增后获得高滴度的Ad一HSP7O病毒液。将Ad一HSP70腺病毒重组体体外转染肠上皮细胞IEC一6，观察目的基因在肠上皮细胞中的表达。利用肠上皮细胞体外缺氧复氧模型，观察Ad一HSP70转染细胞后对LDH漏出、细胞活力、细胞凋亡、细胞内游离钙浓度、细胞内ATp含量、能荷及线粒体膜电位的影响，检测HsP70，Bd一2，Caspase一3及CytochromeC的表达和分布情况0 二、主要结果: 1.烧伤后3h肠粘膜组织内HSP7OmRNA及蛋白表达显著增加，分别在伤后6h、12h达高峰，在伤后48h仍高于正常对照;伤后3h大鼠肠粘膜组织HSFI出现一过性降低，伤后6h其表达显著高于正常对照，并呈逐渐增加的趋势持续到伤后48h。 2.在伤后早期即可出现明显的肠粘膜损害病理学改变，在伤后12、24h损害最为严重。细胞器中线粒体损害最为明显。伤后血浆D一乳酸、DAO及内毒素水平较正常对照明显升高，在伤后6一12h达高峰，持续到伤后48h仍高于正常;烧伤后肠上皮细胞凋亡率明显增加，在伤后12h达高峰。 3.亚砷酸钠预处理对大鼠严重烧伤后早期肠粘膜屏障的损害存在保护作用，表现为粘膜损害评分减低，肠上皮细胞线粒体损伤减轻，肠上皮细胞凋亡减少，伤后血浆D一乳酸、DAO及内毒素水平显著低于单纯烧伤组，组织过氧化损伤也减轻，该保护作用伴随着亚砷酸钠预处理诱导肠粘膜组织HSP7O表达的增强，而用榭皮酮抑制亚砷酸钠对肠粘膜组织HSP7O表达的诱导后，亚砷酸钠对烧伤大鼠肠粘膜的保护作用被抵消;亚砷酸钠预处理可显著增加烧伤后肠粘膜组织内Bd一2蛋白的表达。第三军医大学博士学位论文 4.成功构建了复制缺陷型腺病毒重组体Ad一HSP70，体外转染肠上皮细胞后可诱导细胞内HSP7O基因的高表达。Ad一HSP7O转染组肠上皮细胞缺氧复氧后的细胞活力明显增强，LDH漏出及细胞凋亡减少。 5.Ad一HSP7O转染可显著增加肠上皮细胞缺氧复氧后细胞内ATP的含量及能荷，保护线粒体整体功能，Ad一HsP7O转染组细胞缺氧复氧后细胞内游离caZ+浓度?