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胚胎干细胞源的心肌细胞移植治疗心肌梗死是目前的研究热点,具有很大医学研究价值和临床应用潜能。临床上治疗心肌梗死,有关移植用心肌细胞来源主要存在两个亟待解决的问题:一是如何提高心肌细胞的分化效率；二是如何大量获得相对均一的可供临床使用的移植用心室细胞。针对这两个问题,我们对人类胚胎干细胞(hESCs)向心肌细胞分化的策略进行探索,增加心肌细胞的分化效率,并诱导其向心室细胞分化。
本论文首先通过筛选不同细胞因子,建立了单层hESCs直接分化为心肌细胞的基本程序。在此基础上,为了获得更高的分化效率,我们进一步检测了Noggin和RAi(Retinoic Acid inhibitor)对心肌分化的影响。实验发现,在第4-5天单用Noggin或在第6-9天单用RAi(BMS-189453)能够明显增加hESCs向心肌分化的效率。Noggin和RAi共同作用诱导心肌分化的效率为73±2.08％(mean±s.e.m.),比Noggin单用组的分化效率(50±3.06％,mean±s.e.m.)显著增加,其心肌特异性marker Nkx2.5和CTNT的表达水平比Noggin单用组和基本程序组也显著增加。免疫荧光检测显示,分化的心肌细胞能够表达心肌典型marker:CTNT、α-Actinin、MLC-2A、MLC-2V和β-MHC。上述实验结果表明,在起始分化后使用Noggin,接下来结合RAi,能够明显增加hESCs向心肌细胞分化的效率。
此外,我们还进行了定向分化心室和心房细胞的研究,在第6-8天分别添加RA(Retinoic Acidl)和RAi到Noggin处理的细胞中。形态学观察显示,Noggin+RA组分化的心肌细胞明显比Noggin+RAi组的小,跳动快。QPCR检测显示,Noggin+RAi组心室发育特异性基因IRX4的表达从第8天开始升高,到第14天时比Noggin+RA组的高10多倍。Western blot和免疫荧光检测表明,两组CTNT的表达量相当,而Noggin+RAi组高表达心室肌细胞特异性基因MLC-2V,Noggin+RA组几乎不表达MLC-2V；Noggin组表达MLC-2V较弱,介于Noggin+RAi组和Noggin+RA组之间；MLC-2A和ANF在Noggin+RA组的表达比Noggin+RAi组高。电生理鉴定显示,Noggin+RAi组分化的心肌细胞83％(n=23)具有心室肌样动作电位,而Noggin+RA组分化的心肌细胞94％(n=19)具有心房肌样动作电位。钙火花检测显示,Noggin+RAi组和Noggin+RA组分化的心肌细胞分别有87.5％(14/16)和81.8％(18/22)具有心室和心房细胞钙火花特征。上述研究结果表明,抑制或激活RA信号能够将Noggin处理的细胞定向分化为具有正常生理特征的心室或心房细胞。
综上所述,本论文首次建立了定向、高效、直接的心室和心房肌细胞的分化方法,分化的心室和心房细胞具有正常生理特征。研究揭示了Noggin和RAi促进人类心肌分化的最佳时间窗口,通过控制RA信号通路,在Noggin分化程序的第6-8天添加RA或RAi,可实现hESCs向心房或心室细胞定向分化。该项研究成果为临床心肌梗死治疗中心肌细胞来源问题的解决提供了崭新的希望和坚实的理论依据。