目的:肿瘤化疗失败的主要原因是肿瘤细胞多药耐药性（multidrug resistance,MDR）的产生,即肿瘤细胞一旦对某种药物产生耐受,对其它结构各异、作用机制不同的化疗药物也产生交叉耐受,从而使肿瘤治疗的效果得不到显著提高,这一现象给临床治疗带来极大的障碍。MDR有多种机制,P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）过表达是肿瘤细胞多药耐药的主要原因。P-gp由MDR1基因编码,又称ABCB1,是ATP结合盒（ATP-binding cassette,ABC）转运输蛋白家族成员之一,可通过ATP依赖的药物运输泵机制将细胞毒性试剂从细胞内运送到细胞膜外。白血病治疗主要依靠联合化疗和骨髓移植,临床上成年急性髓性白血病（acute myeloid leukemia,AML）患者中60-80%常规化疗后可以完全缓解,随着年龄增长复发/难治患者比例明显升高,且有研究表明复发难治患者白血病细胞P-gp表达明显高于治疗敏感组。P–gp在CD34⁺干细胞和恶性白血病细胞中表达,随着白血病细胞的分化,P–gp表达呈下降趋势,但CD34⁺表达与白血病细胞P-gp表达及功能的相关性还不十分清楚。P-gp表达被认为是临床急性髓性白血病不良预后的独立因素,且已经开展应用P-gp抑制剂逆转耐药的辅助治疗,但效果不佳。三氧化二砷（As₂O₃）是具有2000多年历史的传统中药,1985年被用于急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia,APL）治疗,目前As₂O₃在APL和一些实体瘤的治疗上都取得了一定的疗效。近来发现砷剂有抑制P-gp表达的作用,但目前关于三氧化二砷逆转多药耐药的作用机制仍不清楚。研究发现各种细胞压力如DNA损伤、血清饥饿等都可使MDR1发生活化,MDR1基因上游启动子区缺乏一般编码蛋白基因具有的TATA盒,而是具有与NF-Y和Sp家族转录因子结合的反向的CCAAT和GC富集区,这些转录因子蛋白可募集组蛋白乙酰转移酶启动周围组蛋白乙酰化,使染色质重塑,从而激活MDR1启动子,有研究报道表皮生长因子（EGF）、肿瘤坏死因子TNF-α、阿霉素、核因子κB（NF-κB）等各种活化信号都可刺激MDR1表达。Mathas等研究表明NF-κB除了可诱导抗凋亡基因表达而产生抗凋亡作用以外,还可直接诱导P-gp表达。Bentires-Alj等证实MDR1基因启动子区域的第一内含子内存在一个NF-κB结合序列,并且NF-κB能够激活连接MDR1启动子的报告基因转录,这提示As₂O₃可能通过抑制NF-κB来诱导细胞凋亡和抑制MDR1的表达,从而产生逆转耐药的作用。因此,本研究拟通过对AML患者白血病细胞P-gp表达、功能及其与CD34表达相关关系的分析和通过体内、体外实验检测As₂O₃对P-gp表达的影响,以及As₂O₃是否通过NF-κB途径影响MDR1启动子活性等进行分析,探讨As₂O₃逆转AML白血病细胞耐药机制,为AML临床化疗方案的制定提供依据。方法:本研究以85例临床AML患者、白血病药物敏感细胞系K562/S和耐药细胞系K562/D为研究对象,用免疫细胞化学方法检测AML患者白血病细胞P-gp表达和CD34表达,用流式细胞术检测P-gp功能,分析了CD34表达、P-gp表达及功能与临床急性髓性白血病病人耐药的相关关系;为证明As₂O₃是否具有逆转P-gp表达及耐药功能的作用,分别采用对P-gp表达阳性的3例复发/难治患者使用As₂O₃进行药物治疗,As₂O₃10mg每日一次静脉滴注,持续治疗4天;分离9例P-gp表达阳性患者外周血单个核细胞进行体外培养,用终浓度为1μM的As₂O₃处理,用Real-time PCR方法检测用药前后原代培养的急性髓性白血病细胞和K562/D细胞的MDR1表达变化;K 562/D细胞以相同方式进行药物处理,用流式细胞术检测As₂O₃作用前后K562/D细胞总P-gp表达及药物释放功能的变化;为进一步分析As₂O₃逆转耐药的机制,用EMSA方法体外鉴定MDR1启动子区NF-κB反应元件,并通过Western印迹杂交实验检测As₂O₃对K562/D细胞NF-κB亚基p65、抑制因子IκB和磷酸化的IκB表达水平的影响;并通过构建MDR1启动子萤光素酶报告系统分析了NF-κB刺激因子TNF–α对MDR1启动子活性的调节作用和As₂O₃对TNF–α诱导的MDR1启动子活性的调节作用,并进一步构建野生型、突变型IκB表达载体和p65siRNA,通过萤光素酶报告基因检测系统鉴定NF-κB反应元件在As₂O₃对MDR1启动子活性调节中的作用。结果:免疫细胞化学实验显示63例初治组中23例P-gp⁺_表达,占36.5%;22例复发/难治组中11例P-gp⁺_表达,占50.0%,两组无显著差异（P>0.05）。63例初治组中P-gp⁺_功能18例,占28.6%,22例复发/难治组中P-gp⁺_功能13例,占59.1%,复发/难治组高于初治组（P<0.05）;63例初治组中20例CD34⁺,占31.7%;22例复发/难治组中13例CD34⁺,占59.1%,高于初治组（P<0.05）。CD34表达与P-gp表达呈正相关（P=0.0001.r=0.483）;CD34表达与P-gp功能也呈正相关（P=0.0001,r=0.550）;3、63例初治AML患者按年龄分为<50岁和≥50岁的年龄分组,46例<50岁初治组中8例CD34⁺（17.4%）,12例P-gp⁺_表达（26.1%）,9例P-gp⁺_功能（19.6%）;17例（≥50岁）初治组中11例CD34⁺（64.7%）,11例P-gp⁺_表达（64.7%）,9例P-gp⁺_功能（52.9%）,≥50岁组均高于<50岁组（P<0.05）;Real-time RT-PCR结果显示体内和原代培养急性髓性白血病细胞和耐药细胞系经As₂O₃作用后总MDR1表达下调;流式细胞术检测K562/D细胞经As₂O₃作用后P-gp表达及药物释放功能明显下降;EMSA实验在体外证明了MDR1启动子区+561⁺571为NF-κB反应元件;Western印迹杂交结果显示As₂O₃使K562/D细胞IκB降解减少,磷酸化IκB水平降低,核NF-κB p65减少;应用萤光素酶检测系统证明了TNF–α对MDR1启动子有正调控作用,As₂O₃可抑制TNF–α诱导的MDR1启动子活性;萤光素酶报告基因系统证明细胞转染野生型和突变型IκB表达载体后As₂O₃通过NF-κB反应元件对TNF–α诱导的MDR1启动子活性的抑制减弱,后者比前者减弱程度小;萤光素酶报告基因检测系统证明细胞转染p65siRNA后As₂O₃通过NF-κB反应元件对TNF–α诱导的MDR1启动子活性抑制明显减弱。结论:1、MDR1高表达是临床急性髓性白血病病人耐药的主要原因。2、As₂O₃可使K562/D细胞和临床急性髓性白血病细胞MDR1表达下调。3、As₂O₃可通过NF-κB通路逆转P-gp调节的白血病细胞耐药,MDR1基因上游存在一段NF-κB特异结合序列,NF-κB可通过与该序列结合调节MDR1基因表达,As₂O₃可能通过抑制磷酸化酶活性来抑制IκB磷酸化,进而抑制NF-κB活性,抑制MDR1基因表达,逆转白血病细胞耐药。