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非生物胁迫严重影响植物的生长和发育,利用基因工程对作物进行遗传改良提高其抗逆性,是保障作物高产优质安全生产的有效途径,具有广阔的应用前景。多胺在植物细胞内参与诸多生命活动,并参与植物的抗逆性形成,SAMDC是多胺生物合成的关键酶,苹果MdSAMDC2基因的表达能够被低温、干旱和盐等逆境诱导上调,而其在植物体内的生物学功能还没有验证。为了确定MdSAMDC2的表达模式,本研究通过TAIL-PCR技术分离了该基因的启动子,初步研究了该启动子的启动活性;通过Gateway技术构建了MdSAMDC2的植物表达载体,并导入烟草使该基因过量表达,进一步研究了逆境条件下该基因的表达水平,测定了各项抗性生理指标,表明过量表达MdSAMDC2能够提高转基因烟草的抗逆性。ICE1(Inducer of CBF expression 1)是CBF3的正调节因子,已有研究表明,过量表达ICE1能够明显提高转基因拟南芥的耐寒性,说明ICE1在植物耐寒性形成中起重要作用。本研究从苹果中克隆到MdICE1基因,并对其表达和功能进行了初步研究,转基因研究表明MdICE1过量表达可以提高烟草的耐寒能力。主要结果和结论如下:1、根据MdSAMDC2基因的cDNA序列,设计了该基因编码区的3′和5′端引物并进行克隆,利用Gateway技术构建了植物表达载体,通过农杆菌浸染法转入烟草,PCR检测证明MdSAMDC2基因已经整合到烟草基因组中,RT-PCR表明MdSAMDC2在烟草中得到表达,所有转基因植株生长正常,能够完成生活史。用HPLC测定了转基因植株的多胺水平,发现转基因植株的多胺含量明显上升,并且不同多胺的比例发生了变化,Spd比例相对提高,Put和Spm的比例相对下降。分别用低温、20%PEG模拟干旱和NaCl等逆境胁迫进行处理,分析了转基因植株的抗逆生理生化变化,发现在逆境条件下,过量表达MdSAMDC2可以提高Spd和Spm的积累,降低Put含量,同时提高了脯氨酸含量以及SOD和CAT的酶活性,降低了MDA含量,表明转基因烟草抗逆性得到了提高。2、根据MdSAMDC2的5′端序列设计3条反向引物和4条随机兼并引物,以苹果基因组DNA为模板,利用改进TAIL-PCR法克隆到了长度为680bp的MdSAMDC2启动子,序列分析表明,该启动子区包含多种逆境诱导启动子的特异序列元件,如ACGTA序列元件、ASF1元件、MYC识别位点、MYB1和MYB2识别位点等。构建了该启动子和GUS基因的重组表达载体,将重组质粒导入农杆菌LBA4404,用农杆菌介导法转入烟草,GUS染色显示转基因烟草的叶片为蓝色,表明该启动子具有启动活性。3、为了验证不同抗性水平苹果砧木在逆境下的多胺反应,以山定子(M. baccata Borkh)、新疆野苹果(M. sieversii(Ledeb)Roem)、烟台沙果(M. prunifolia(Willd)Borkh)和莱芜难咽(M. micromalus Makino)等4种苹果砧木为试材,测定了低温胁迫下不同砧木叶片的多胺含量变化及MDA、抗氧化酶的变化等生理指标。结果表明,低温胁迫能明显诱导多胺总量(PAs)、腐胺(Put)、亚精胺(Spd)和精胺(Spm)的发生,耐寒性强的山定子和新疆野苹果PAs、Put和Spd增加显著,相关分析表明,叶片MDA相对增加量与PAs、Put和Spd的增加量呈极显著负相关,与Put/PAs比值呈显著负相关,而与(Spd+Spm)/Put、Spd/PAs、Spm/PAs呈显著正相关,表明当低温胁迫下叶片PAs、Put、Spd增加量较大时,苹果砧木耐低温胁迫的能力比较强。4、以苹果为材料,利用同源序列法和RACE技术克隆苹果MdICE1的全长cDNA序列(GenBank登录号为EF495202),该cDNA长度为1890bp,编码531个氨基酸,保守性分析表明,MdICE1蛋白质序列上包含由60个氨基酸残基组成的bHLH(basic Helix-Loop-Helix)功能域,同源性比较表明,不同bHLH蛋白功能域的同源性高达90%以上。将该蛋白氨基酸序列与拟南芥等植物的bHLH蛋白进行在线多重序列比较,并构建系统树,发现MdICE1与拟南芥ICE1(AAP14668)同源性最高,系统树将这两个蛋白聚为一类,因此可以确定MdICE1是拟南芥ICE1在苹果中的一个同源基因,编码bHLH类蛋白。表达和功能分析结果如下:①构建了MdICE1的原核表达载体pET-30(a)+MdICE1,转化BL21,筛选重组菌株。经IPTG诱导后,SDS-PAGE发现大小为64.5kDa的特异蛋白产物。②将MdICE1-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞内瞬时表达,只在细胞核中观察到绿色荧光,表明MdICE1定位于细胞核,Northern杂交结果表明MdICE1表达受低温和盐胁迫诱导。③将MdICE1插入pBI121构建表达载体,利用农杆菌浸染法将35S::MdICE1转入烟草。PCR检测表明MdICE1已经整合到烟草基因组中,RT-PCR表明MdICE1在转基因烟草中能够表达。用低温胁迫处理转基因株系,分析了该基因表达模式和转基因植株的抗逆生理生化变化,表明过量表达MdICE1的转基因烟草的抗寒性明显提高。