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研究背景近年临床证明,5-氨基酮戊酸光动力疗法(Aminolevulinic acid photodynamic therapy,ALA-PDT)具有嫩肤效应,可用于治疗皮肤光老化,能够显著改善老化皮肤的细纹、点状色素沉着、皮肤粗糙等。ALA-PDT治疗光老化一般先局部用ALA封包一定时间,继而被吸收并在组织内转化成光敏剂原卟啉Ⅸ(ProtoporphyrinⅨ,PpⅨ),再使用合适剂量的红光(635nm)照射。PpⅨ可吸收光子能量,由基态变成激发态,产生大量活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS),调节脂质过氧化反应,引起直接或间接的细胞毒性效应。既往有研究推测,ALA-PDT治疗皮肤光老化的机制可能主要是刺激了局部炎症反应,启动了皮肤创伤修复机制,但尚未有关其对真皮光老化成纤维细胞的影响及作用机制的研究报告。目的通过不同的ALA孵育时间及红光照射剂量作用于正常及中波紫外线(UVB)应激性衰老(UVB Stress-induced premature senescence,UVB-SIPS)人皮肤成纤维细胞(Human dermal fibroblasts,HDFs),观察细胞内ROS、线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)水平,证明ALA-PDT对光老化皮肤成纤维细胞是否具有氧化损伤作用,以及进一步引起细胞形态、增殖活性及凋亡水平的变化,从而初步探讨ALA-PDT治疗皮肤光老化的机制。方法1.细胞分离及培养人皮肤成纤维细胞取自成年健康男性包皮组织,取5-10代对数生长期的细胞进行实验。2.UVB-SIPS造模细胞连续培养5天,每日1次照射UVB,每次剂量10 m J/cm~2,总剂量50 m J/cm~2。3.红光照射及剂量计算以635nm红光照射细胞,功率50 m W/cm~2;红光剂量=红光功率×时间(秒)。4.ALA浓度和孵育时间筛选激光共聚焦显微镜检测细胞内Pp IX荧光强度。5.细胞内活性氧、线粒体膜电位水平检测荧光显微镜和流式细胞仪检测胞内活性氧含量和线粒体膜电位水平。6.细胞增殖活性检测CCK-8法检测ALA-PDT对细胞增殖的影响。7.细胞凋亡检测光学显微镜观察细胞形态改变、Hoechst染色和流式细胞仪Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡水平。结果1.UVB-SIPS-HDFs摄取ALA最佳浓度与作用时间的筛选激光共聚焦显微镜观察到:1.00mmol/L ALA孵育UVB-SIPS-HDFs 6小时,胞内PpⅨ荧光强度值最大(P<0.05)。2.ALA-PDT对UVB-SIPS-HDFs胞内活性氧、线粒体膜电位的影响与对照组相比,ALA-PDT组细胞内ROS、MMP荧光强度增大(P<0.05),且与照光剂量和ALA孵育时间呈正相关。同一处理下,正常HDFs细胞内ROS、MMP荧光强度均高于UVB-SIPS组,差异有统计学意义(P<0.05)。3.ALA-PDT对UVB-SIPS-HDFs细胞增殖活性、凋亡率的影响与对照组相比,ALA-PDT组细胞增殖活性下降、凋亡率上升,差异有统计学意义(P<0.05),且与照光剂量和ALA孵育时间呈正相关。相同处理下,正常HDFs细胞增殖活性较UVB-SIPS组降低、凋亡率上升,差异有统计学意义(P<0.05)。结论本研究初步证实ALA-PDT对UVB-SIPS-HDFs有氧化损伤效应,引起细胞凋亡和增殖减慢,且与ALA孵育时间、红光剂量呈量效依赖性关系,这可能提示了临床上光动力疗法嫩肤的机制。