研究背景:卵泡刺激素(FSH)是由腺垂体嗜碱性细胞所分泌的一种促性腺激素,其主要作用是调控生长、发育、性成熟及生殖相关的生理活动。FSH水平的变化贯穿女性一生,并与女性各个重要的生理期变化密切相关。青春期女性血FSH、LH水平快速升高,促进卵巢的卵泡发育、成熟并增加雌激素分泌,进而促进女性性成熟。妊娠期及产褥期女性FSH及其它性激素水平显著变化,调节母体相应器官发生适应性变化以保证胎儿和婴幼儿的生长、发育。女性在更年期卵巢功能开始衰退,雌激素分泌功能下降、FSH水平升高,与多种绝经相关性疾病有关。在月经经前期、妊娠期、产褥期、绝经期过程中,女性的抑郁症患病率均明显升高,与其性激素水平显著变化有关,性激素水平变化诱发易感女性的情感障碍,说明性激素可能参与情绪调控及抑郁症的发病机制。因此理解性激素的神经调节作用不仅有助于我们更好地认识神经生理功能,还对于抑郁症的预防、治疗有着重要的临床意义。FSH作为一种性激素,在各生理期显著变化,然而其与抑郁症的关系并不清楚,FSH是否参与抑郁症的发病机制有待研究。完善理解FSH可能的情绪调控作用,将对阐明性腺轴与中枢神经系统相互作用机制有着重要意义,同时也可提出新的潜在性激素相关抑郁症的治疗干预靶点,解决临床实际问题。研究发现FSH的受体(FSHR)存在于骨、肝脏、脂肪、脑等性腺外器官,FSH的性腺外作用已被研究者广泛关注。FSHβ敲除小鼠和FSHR敲除小鼠的骨量增加,破骨细胞重吸收减少。FSH作用于破骨细胞及其前体上的FSHR,激活MEK/Erk、NF-κB、Akt,促进破骨细胞的形成和功能。FSH作用于肝脏细胞上的FSHR激活Gi2 a/β-arrestin-2/Akt通路,抑制Fox01与SREBP-2启动子的结合,促进SREBP-2的基因转录进而提高肝胆固醇含量。FSH激活脂肪细胞的FSHR,提高cAMP反应元件结合蛋白磷酸化,促进脂肪合成及脂滴形成。FSH通过血管内皮细胞FSHR,激活FSHR/GαS/cAMP/PKA和PI3K/Akt/mTOR/NF-κB通路,提高血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)的表达,促进血管粥样板块形成。因而阻断FSH信号通路被认为是治疗绝经相关性骨质疏松、肥胖、动脉粥样硬化的重要途径和策略,而易感女性在绝经期往往伴随着情绪障碍等表现,阻断FSH信号通路是否存在神经系统相关作用目前尚无报道。近年来,研究者通过原位杂交及免疫组化等方法证实:海马、小脑等脑组织的部分神经元不仅可以合成FSH,而且存在FSHR。这暗示FSH信号通路在神经元中存在着生物学作用,而其具体的作用及机制仍不清楚。另外,阻断FSH信号通路用于治疗绝经相关性骨质疏松、肥胖、动脉粥样硬化,是否会改善或加重易感女性抑郁症症状值得我们进一步关注。因而研究FSH信号通路在神经系统的作用,尤其是其在情绪调控中的作用,具有重要的生物学及临床价值。抑郁症的发病机制目前存在多种学说,包括单胺递质、下丘脑-垂体-肾上腺轴、炎症、神经可塑性、神经生发、基因、环境作用等。氧化应激在抑郁症的诸多发病机制学说中有着重要地位,它是一种氧化还原失平衡状态,即氧自由基(ROS)产生增多或清除减少。还原型谷胱甘肽(GSH)是一种体内天然的ROS的清除剂,其在抑郁症患者和压力诱导抑郁小鼠的脑组织中均明显下降。而补充GSH或其前体物质乙酰半胱氨酸(NAC)可以缓解糖尿病大鼠及压力诱导抑郁小鼠的抑郁样行为。而FSH可以促进卵巢颗粒细胞中GSH的合成,起到抗氧化应激、抗凋亡的作用,对卵泡的发育、增殖有着重要意义。那么FSH信号通路是否同样调控神经系统氧化还原稳态,参与抑郁症发病机制值得我们进一步研究。本研究中,我们通过体内(Fshr基因敲除小鼠)与体外水平(FSH处理N2a神经元)研究,观察小鼠行为学变化、脑组织氧化还原稳态情况和基因谱表达变化,及FSH对神经元氧化还原稳态的影响;初步探讨了 FSH的神经调控作用,FSHR缺失在小鼠抑郁样行为发生中所发挥的作用及其机制。为探究抑郁症发病机制及治疗提供了新的观点;为FSH性腺外作用提供了新的实验证据。目的:1、通过Fshr基因敲除小鼠(Fshr-/-)抑郁样行为的检测,明确FSH信号通路是否与抑郁症相关。2、通过检测Fshr-/-小鼠脑组织中氧化应激水平,及脑组织基因谱表达的变化,探讨FSH信号通路对抑郁样行为的调节作用。3、通过检测NAC处理的Fshr-/-小鼠抑郁样行为变化,及FSH处理的N2a细胞的氧化应激水平变化,探讨氧化应激在Fshr-/-小鼠的抑郁样行为发生中的作用。研究方法:1、动物模型:8周龄雌性Fshr+/+与Fshr-/-小鼠,行卵巢摘除术以去除雌激素影响。根据实验设计分组:(1)Fshr+/+组与Fshr-/-组。(2)Fshr+/+生理盐水处理组;Fshr-/-+生理盐水处理组;Fshr+/+NAC处理组;Fshr-/-+NAC处理组。2、利用免疫荧光技术检测FSHR在各情绪调控相关脑区的表达。3、动物行为学检测:应用强迫游泳实验(FST)、高架迷宫实验(EPM)、悬尾实验(TST)、糖水偏好实验、水迷宫(MWM)、旷场实验(OFT)、滚轮实验检测小鼠行为学改变。4、脑组织氧化应激水平检测:采用GSH assays试剂盒检测小鼠脑组织匀浆的GSH/GSSG比值水平变化。5、脑组织基因谱表达检测:采用RNA-sequencing技术检测小鼠脑组织基因表达谱的变化。对部分基因表达采用Rea1 time-PCR进行检测。6、血清中各性激素水平检测:利用ELISA检测小鼠血清中FSH、LH、雌激素、雄激素水平变化。7、细胞培养:N2a神经细胞按培养条件培养。根据实验设计分组:N2a细胞对照组(PBS 3h);N2a细胞H202处理组(PBS预处理2h后+200μM H202处理1h);N2a细胞FSH+H2O2处理组(50ng/mL FSH预处理2h后+200μM H202处理1h)。8、细胞氧化应激水平检测:利用Mitosox试剂盒检测活细胞内产生的ROS水平变化。9、调控GSH合成及转换的关键基因表达检测:利用蛋白免疫印迹方法进行检测GCLm、GCLc、G6PD蛋白表达水平变化。10、采用SPSS 20.0软件统计、分析实验数据。所有数据采用均数±标准差(mean±SD)表示。两组间均数比较采用Student’s t-test分析;多组间均数比较采用one-way ANOVA分析。结果:1、FSHR在多个情绪调控相关脑区中表达。通过免疫荧光技术,我们发现FSHR存在于多个情绪调控相关脑区:海马、皮质、伏核、杏仁核、前额皮质;而在终纹床核和外侧系带未发现FSHR表达。并且FSHR与神经元生物标记物NeuN共表达,即FSHR存在于神经元上;FSHR与星型胶质细胞生物标志物GFAP未发现共定位,即FSHR不存在于星型胶质细胞。2、Fshr-/-小鼠表现出更严重的抑郁样行为。Fshr/+小鼠与Fshr-/-小鼠血中主要性激素(FSH、LH、雌二醇、睾酮)水平无明显差异。与Fshr/+小鼠相比,Fsh-/-小鼠在FST中表现出更长的不动时间(8.59±3.28s VS 26.8±5.48s,P<0.05),说明Fshr基因敲除可诱导抑郁样行为,增加小鼠在压力环境中的绝望行为,而且两种的小鼠行为学差异并非由LH、雌二醇、睾酮激素差异引起。3、Fshr基因敲除引起小鼠脑组织还原氧化失稳态,增加氧化应激水平。与Fshr+/+小鼠相比,Fshr-/-小鼠脑组织匀浆的GSH/GSSG比值明显下降(1.07±0.10 VS 0.41 ± 0.09;P<0.05),且海马、皮质、前额皮质、杏仁核组织均表现出相似的结果,说明Fshr基因敲除可增加脑组织氧化应激水平,引起中枢神经系统还原氧化失稳态。4、ROS清除剂NAC处理可以缓解Fshr-/-小鼠抑郁样行为并降低其氧化应激水平。Fshr+/+小鼠和Fshr-/-产小鼠给予NAC(150mg/kg体重)或生理盐水腹腔注射处理,检测其抑郁样行为和脑组织GSH/GSSG 比值。Fshr+/++生理盐水处理组VS Fshr-/-+生理盐水处理组VS Fshr+/+ +NAC处理组VS Fshr-/-+NAC处理组在强迫游泳实验中的不动时间:8.70±10.0s VS 25.86 ± 17.74s VS 4.82±5.26s VS 8.20±6.77s,P<0.05;脑组织匀浆 GSH/GSSG 比值:1.41±0.37 VS 0.36±0.23 VS 1.60±0.31 VS 1.58±0.41,P<0.05。NAC可以明显降低Fshr-/-小鼠脑组织氧化应激水平,并改善其抑郁样行为,说明氧化还原失稳态是Fshr-/-小鼠抑郁样行为的主要原因。5、FSH处理可以减少H2O2诱导ROS的产生,降低N2a细胞氧化应激水平。与对照组相比,H202处理可以明显升高N2a细胞Mitosox荧光强度,而FSH预处理可以降低H202诱导的Mitosox升高的荧光强度。Con组VS H2O2处理组VS FSH+H202处理组 Mitosox 免疫荧光水平:3.38±0.87 VS 10.83±2.48 VS 5.23±2.42,P<0.05,说明FSH处理可以降低细胞氧化应激水平。6、FSH调控GSH合成及转换的关键基因GCLm及G6PD的表达。蛋白质免疫印迹显示:较对照组FSH 50 ng/mL及100 ng/mL处理可以上调N2a细胞中GCLm、G6PD的蛋白水平表达,与之相符的是较对照小鼠Fshr-/-小鼠脑组织GCLm、G6PD表达水平下调。7、Fshr基因敲除改变海马、前额皮质等情绪调控相关脑区的基因表达谱。RNA-sequencing显示,Fshr+/+小鼠与Fshr-/-小鼠海马、前额皮质组织基因表达谱有明显差异,说明Fshr基因敲除明显改变了中枢神经系统的基因表达谱。结论:1、Fshr基因敲除可以诱导小鼠出现抑郁样行为。2、ROS清除剂可以缓解Fshr-/--小鼠的抑郁样行为。神经元氧化还原失稳态在Fshr-/-小鼠抑郁样行为的发生中具有重要地位,发挥了关键作用。3、FSH信号通路参与GSH的合成和转换,进而调控神经元氧化还原稳态。4、虽然通过阻断FSH信号通路被临床学家及药理学家认为是治疗绝经相关性疾病重要途径和策略,但它可能带来的中枢神经系统相关的副作用值得关注及进一步研究。