一、研究背景和目的肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球高发的恶性肿瘤之一,严重威胁着人类生命健康,肝癌病因尚未明确,早期无明显症状,容易发生转移,这些是导致其预后差,病死率居高不下的重要因素。肝癌的发生发展是一个多阶段、多步骤、多因素的复杂过程,近年来,一些重要的信号通路在肝癌发生发展中的作用得以阐明,然而,肝癌早期诊断难,晚期治疗效果差的现状仍然没有被改变。因此,深入理解肝癌发生发展的分子机制,寻找新的诊治靶点迫在眉睫。microRNAs(miRNAs)是一类内源性非编码小分子RNA,长约19-25个核苷酸(nucleotide,nt),通过结合靶基因mRNA的3’非翻译区(3’untranslated region,3’-UTR),阻遏靶基因的翻译,从而抑制基因表达。miRNA参与动植物的组织器官发育、细胞分化和凋亡、胰岛素分泌、脂肪代谢等生命活动,在许多病理过程包括癌症发生及癌细胞转移中扮演重要的角色。miRNAs作为一类新型的调节因子,既可以作为原癌基因发挥作用,也可以作为抑癌基因调节细胞的生物学特性。目前为止,已发现多个发挥原癌基因或肿瘤抑制基因作用的miRNAs,如miR-17-92cluster、let-7、miR-143、miR-21和miR-373、miR-145、miR-372以及miR-98等,它们通过调控下游靶基因的转录和翻译参与了肿瘤的演进过程。肝癌的发生机制比较复杂,目前研究发现染色体突变、表观遗传、非编码RNA基因的突变及蛋白编码基因突变等均与肝癌的发生发展密切相关。尽管在肝癌中发现了许多癌基因和肿瘤抑制基因,但microRNA小分子在肝癌生物学中的功能则是近几年来才被开始关注。miRNA在肝细胞癌发生过程中的功能以及与肝细胞癌诊断、治疗的关系是目前备受关注的课题之一,与肝细胞癌发生发展相关的miRNA研究证实有很多,如miR-23a、miR-27a、miR-223、miR-21、miR-221及miR-17-92等,它们可以通过抑制或促进相关癌相关基因的表达而发挥重要的作用。由此可见,miRNAs调节HCC发生发展的分子机制研究可能为肝癌的早期诊断和治疗提供一种新的途径。Hsa-miR-98(miR-98)首先从Hela细胞中克隆得到,全长21nt,在多种组织中泛表达,无组织特异性。miR-98的表达失调参与了多种肿瘤的发生发展和侵袭转移,如肺癌、乳腺癌和结肠癌等。miR-98家族是一个高度保守的微小RNA家族,可以调控RAS、MYC、HMGA2、CDC25A、CDK6等靶基因,与生命中的多种生物学现象和生理过程息息相关,特别是在细胞增殖与分化以及肿瘤相关方面的作用尤为突出。人体内let-7/miR-98家族成员表达失调参与一些疾病的发生发展,比如miR-98异常表达在乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌中起了一定的作用。还有研究表明,miR-98通过Fas家族可以直接作用于Fas基因的3’-UTR区域,调节Fas基因的表达,并影响Fas介导的细胞凋亡,miR-98在SC I型细胞中低表达,在SCⅡ型细胞中高表达,这与miR-98负向调节Fas是一致的。成熟的miRNA可以与其他蛋白质一起组成RISC (RNA-induced silencing complex)复合体,通过核酸序列互补与靶基因mRNA的作用,miRNA主要是在数量上对靶基因进行调节作用。这展示了miRNA在临床应用方面的巨大前景。但是miR-98和肝癌的关系尚未报道,我们前期结果提示miR-98在肝癌组织中表达明显高于正常对照组。本课题的研究目的为鉴定miR-98在肝癌细胞和组织中的表达特性,然后通过改变miR-98的表达水平观察对于肝癌细胞生物学特性的影响,最后结合生物信息学预测和分析其靶基因,阐明miR-98在肝癌发病机制中所扮演的角色,为深入理解肝癌发病的分子机制和寻找新的分子靶向治疗靶点奠定理论基础。二、研究方法1.荧光定量PCR方法检测肝癌组织、正常肝组织及肝癌细胞株中miR-98的表达取已裂解的组织或收集培养的细胞,加入TRIZOL试剂提取microRNA。采用microRNA反转录试剂盒,逆转录合成cDNA;以cDNA为模板,U6为内对照,采用荧光定量PCR试剂盒,使用Stratagene公司的Mx3000P定量PCR仪进行荧光定量PCR反应,检测各模板的Ct值。2.对miR-98的靶基因进行预测利用miRBase、Pictar和’TargetScan三个经典的在线靶基因预测软件对miR-98的靶基因进行预测,然后三者取交集。随后对该交集中的靶基因进行初步的基因功能分析(Gene Ontology enrichment analysis)。3.慢病毒包装方法构建过表达／干扰miR-98的肝癌细胞株PCR扩增miR-98上下游侧翼序列,TA克隆后,将测序正确的重组T载体与慢病毒表达载体plVTHM分别进行ClaI和MluI双酶切、连接,构建重组慢病毒表达载体plVTHM/miR-98。采用阳离子脂质体法进行慢病毒的包装、测定滴度后,流式细胞仪分选GFP+细胞,筛选稳定过表达／干扰miR-98的肝癌细胞株,荧光定量RT-PCR鉴定GFP+细胞中miR-98的表达。4.MTT法检测肝癌细胞株的增殖能力将细胞接种于96孔培养板,每组5个复孔,同时设空白对照,分别培养1到7天。加入四氮唑蓝盐(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromideMTT)20μ1,37℃培养4h,吸弃培养基,加入二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)150μ1,室温孵育10min,振荡10min,以空白对照孔调零,酶标仪上490nm测定各孔吸光度值,以相对应吸光度比值表示细胞增殖能力大小。5.平板克隆形成实验取生长状态良好的培养细胞,胰酶消化后制成单细胞悬液,以200个/孔接种到12孔培养板中,晃动培养板,使细胞分散均匀,培养箱中培养2周。出现肉眼可见的细胞克隆时,终止培养,弃培养液,D-Hanks液洗2次后,空气干燥,苏木素染色15min,流水洗去染液,空气干燥后显微镜下计数。6. Transwell小室侵袭实验取生长状态良好的培养细胞,胰酶消化后制成单细胞悬液,无血清培养基洗涤细胞2次,调整细胞浓度为(1~2)×106/ml。加100μ1细胞悬液于内室,然后加500μ1含10%新生牛血清的完全培养基于下室,37℃培养18h。取出小室,擦掉未穿过膜的细胞,苏木素复染15min,用蒸馏水冲洗,空气中风干。显微镜下随机选取5个高倍视野计数穿过膜的细胞数。7.流式细胞仪检测细胞周期取对数生长期细胞,胰酶消化后制成0.5ml的单细胞悬液,加入5ml70%乙醇中,封口膜封口。4℃固定过夜,收集固定细胞,力RNase-A约3μl至终浓度约为50μg/ml,37℃水浴消化30min；加PI约50μl至终浓度约为65μg/ml,在冰浴中避光染色30min,用300目(孔径40~50微米)尼龙网过滤,上机检测。8. Western blot法检测CyclinDl的表达取生长状态良好的培养细胞,胰酶消化后收集细胞,加]PMSF混匀,加入0.5ml蛋白提取液,收集细胞蛋白质,用Pierce公司的BCA Protein Assay Reagent Kit对收集的蛋白定量,用8%SDS-PAGE分离胶和5%SDS-PAGE积层胶对蛋白进行凝胶电泳,根据蛋白质Marker所指示的条带位置,切下目的条带,将相应的蛋白转移至PVDF膜上,加相应抗体进行免疫杂交,最后进行化学发光检测。三、结果1.肝癌细胞中miR-98表达的鉴定采用荧光定量RT-PCR的方法检测6种肝癌细胞株中miR-98的表达情况,结果发现miR-98在高转移潜能细胞(BEL-7042、HHCC及BEL-7404)中都有较高程度的表达,低转移潜能(HeP3b、SMMC7721、HePG2)细胞中的表达较低。采用荧光定量PCR的方法检测12对肝癌组织和正常对照组织中miR-98的表达特性,结果显示miR-98在肝癌组织中的表达明显高于正常对照组。上述实验结果提示我们miR-98很可能与肝癌的发生发展有着密切联系。2.miR-98靶基因的预测利用miRBase、Pictar和TargetScan三个经典的在线靶基因预测软件对miR-98的靶基因进行预测,结果显示miRBase预测靶基因有973个,TargetScan预测有1072个,Pictar预测有442个,三者取交集后共有56个靶基因。随后对该56个靶基因进行初步的基因功能分析(Gene Ontology enrichment analysis),发现它们的生物学功能主要包括转录调控、Wnt信号通路的激活、细胞周期调控、转移酶活性、受体活性、金属离子结合、转录因子、RAS蛋白信号转导、及细胞的运动、分化、凋亡、粘附和增殖等。由于这些生物学功能涉及到了肿瘤发生发展及侵袭转移的多个阶段,因而我们推测miR-98在肝癌中的表达失调,可能通过调控下游一系列靶基因的表达进而引起肝癌细胞多方面生物学特性的改变。生物信息学分析预测靶基因的结果提示我们miR-98的表达失调可能会影响肝癌细胞的生物学特性并提供了初步线索,为深入探讨miR-98的调控机制奠定了理论基础。3.miR-98过表达/干扰后细胞的体外增殖情况与阴性对照组细胞相比,SMMC7721-plVTHM/miR-98细胞的增殖能力的吸光度值在4～7天时均升高,差异具有统计学意义(F=26.15,P<0.001)。而miR-98的干扰细胞株的生长能力在4～7天显著低于其对照组(F=-16.29,P<0.001)。4.克隆形成分析平板克隆形成实验显示SMMC7721-plVTHM/miR-98细胞的增殖能力显著高于SMMC7721-plVTHM细胞。(F=38.862,P<0.001)。而miR-98干扰的肝癌细胞株的克隆形成率为9.33%,其对照组细胞克隆形成率为54.66%,差异具有统计学意义(χ2=48.26,P<0.01)。5.肝癌细胞周期分析转染miR-98的肝癌细胞停留在G1期和S期的数目约为G1期66.71%,S期35.89%,显著高于其对照G1=期8.93%,S期26.62%(t=25.76,P<0.05；t=20.12,P<0.05)。转染miR-98inhibitor组的细胞停留在G1期15.88%和S期7.89%的数目明显低于其对照组G1期46.23%和S期26.84%(图4),差异具有统计学意义(t=-42.01,P<0.01,t=-11.566,P<0.05)。6.肝癌细胞体外迁移运动能力分析与SMMC7721-plVTHM相比,SMMC7721-plVTHM/miR-98穿过聚碳酸酯膜的细胞数明显增多,差异具有统计学意义(F=53.881,P<0.001)。而当miR-98干扰后,穿过聚碳酸酯膜的细胞数明显下降,差异具有统计学意义。7. CyclinDl表达分析瞬时转染NC、miR-98NC、miR-98inhibitor到肝癌细胞,48小时后,裂解细胞,收取总蛋白,用Western blot法检测CyclinDl的表达。结果表明miR-98过表达可以显著上调细胞周期因子CyclinDl的表达,差异具有统计学意义(t=15.67,P<0.05)。而当miR-98表达被抑制后,CyclinD的表达明显下降(t=17.45, P<0.05)。四、结论1.荧光定量RT-PCR的结果表明,miR-98在肝癌组织细胞中表达增高。2.生物信息学预测miR-98可能通过调控下游一系列靶基因的转录和翻译引起肝癌细胞生物学特性的改变,参与了肝癌的发病机制。3.miR-98过表达后显著促进了肝癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力,与肝癌的发生发展密切相关。