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研究背景:狼疮性肾炎是SLE最常见的并发症之一,也是一种常见的继发性肾小球肾炎,以肾小球、肾血管和间质损害为特征,后期可发展为肾小球硬化、纤维性新月体、肾小管萎缩和间质纤维化等,终末期发展为肾间质纤维化,导致肾脏功能衰竭,肾脏病变是影响SLE远期预后的最主要因素;因而对狼疮性肾炎肾间质纤维化的发病机制的研究是治疗SLE的一个重要方面。目前研究认为TGF-β1在肾间质纤维化中具有重要的作用,可刺激肾组织炎症过度修复、肾小管上皮转分化,促进肾小球系膜细胞和内皮细胞增生以及ECM的合成和积聚,促使肾小球硬化和肾间质纤维化。研究表明TGF-β1在LN患者肾小管上皮细胞和间质成纤维细胞的表达明显升高,是LN肾间质纤维化过程中重要的刺激因子。其致纤维化作用通过促进ECM合成和抑制其降解来实现的。纤溶酶原激活剂是一种可以激活纤溶酶原转化成纤溶酶的蛋白酶,保持基质形成和纤溶降解处在一种动态平衡中。纤溶酶原激活物抑制物(Pal-l)是血液中纤溶酶原激活剂最有效的生理性抑制剂,它通过与激活剂结合以抑制纤溶酶原激活。TGF-β1可以有效的刺激Pal-l在肾组织的表达,从而抑制ECM的降解,促成其在肾间质大量沉积,这个过程是由ROS介导完成的。在狼疮性肾炎病理中,免疫损伤联合炎症反应,导致肾组织受到各种氧化因素如一氧化氮、脂质过氧化物等的作用而形成损害,最终发展到肾间质纤维化的不可逆性损害。谷胱甘肽(GSH)是人体内抗氧化机制中的最重要因素之一,在机体内可以有效对抗氧化因子的损害作用。最新报道的SLE病人体内GSH水平显著低于正常对照组,并与疾病活动密切相关,因而肾组织GSH水平是影响肾组织损害发展到肾间质纤维化的一个重要因素;并且GSH还可以通过中和ROS抑制TGF-β-1诱导的Pal-l表达,促使ECM降解。氧化损害等多种刺激可不同程度调节肾组织GSH浓度,其中一个重要的调节环节,就是转录水平调控GSH合成的限速酶—γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS),从而调节细胞内GSH浓度,促进肾组织损伤修复或保护肾组织免受氧化损害。综上可知,在LN患者体内GSH水平降低代表抗氧化能力降低,体循环内各种氧化因素直接对肾组织造成损害,并且介导TGF-β1的致纤维化作用。对LN肾组织GSH转录水平的调控因素γ-GCS的研究,将是对LN肾间质纤维化机制研究的一个新的切入点。研究目的:1.对照正常小鼠,观察狼疮鼠模型MRL/1pr小鼠肾组织纤维化因子TGF-β1转录水平和蛋白水平的表达改变。2.对照正常小鼠观察GSH及其合成限速酶γ-GCS在MRL/1pr小鼠肾组织的表达,评估狼疮鼠肾组织抗氧化能力的改变。探讨MRL/1pr小鼠肾组织GSH及γ-GCS表达改变在肾间质纤维化中的作用。3.构建γ-GCS-pEGFP-c1真核表达质粒,培养原代狼疮小鼠肾小管上皮细胞。为后续性研究γ-GCS在肾小管上皮细胞表达做前期准备。方法:1.分组正常对照组:16周龄SPF级C57BL/6雌性小鼠;LN模型组:16周龄SPF级MRL/1pr雌性小鼠,各10只。2.组织染色观察肾组织病理。3.用荧光定量PCR方法检测两组小鼠肾组织γ-GCS和纤维化因子TGF-β1的mRNA水平表达改变。4.免疫组织化学法检测TGF-β1蛋白量改变。5.westernbloting检测肾组织γ-GCS蛋白表达量。比色法检测肾组织GSH水平。6.使用PCR方法克隆γ-GCS序列片段,重组到pEGFP-c1真核表达载体,酶消化法培养原代肾小管上皮细胞。7.用SPSS 13.0统计软件进行分析,数据用均数±标准差( x±s)表示,两样本比较用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。结果:1.病理改变光镜下HE染色切片可见,狼疮鼠组部分肾小管上皮细胞萎缩、脱落,管腔扩张,及小管上皮细胞纤维化,局灶性的小管间质纤维化、空泡化,并可见蛋白管型。2.荧光定量PCR结果采用半定量法对比γ-GCS和TGF-β1在C57BL/6和MRL/1pr小鼠的表达差异,狼疮小鼠组肾组织中γ-GCS的mRNA水平与正常小鼠组比较表达减少,TGF-β1的mRNA表达水平升高,差异有统计学意义,(p均<0.05)。狼疮鼠肾组织GSH水平明显下降(p<0.05)。3.免疫组化结果结果显示TGF-β1主要在肾小管上皮细胞胞浆较高表达。MRL/1pr小鼠的肾小管上皮细胞表达高于正常小鼠(p<0.05)。免疫印迹结果证明γ-GCS在狼疮小鼠肾组织蛋白表达降低(p<0.05)。4.成功构建了γ-GCS-pEGFP-c1真核表达载体,测序结果与γ-GCSmRNA基因序列序列一致。成功培养原代肾小管上皮细胞。早期细胞多呈梭形或圆梭形,苏木素染色可观察到细胞核淡蓝染色,为体积较大的多边鹅卵石样。结论:在LN肾组织,炎症刺激的TGF-β1的高表达引起γ-GCS的表达降低,从而使GSH合成减少,LN患者肾组织氧化-抗氧化系统失衡,肾组织产生的大量ROS介导了纤维化因子TGF-β1在肾组织的促纤维化作用,一定程度上加速了肾间质纤维化的进程。该研究为今后狼疮性肾炎的治疗研究提供了新的指导思路,为狼疮性肾炎致病机理的进一步研究奠定了基础。成功构建了γ-GCS-pEGFP-c1真核表达载体和成功培养原代肾小管上皮细胞,为进一步研究γ-GCS在肾间质纤维化的肾小管上皮细胞中的作用,做了前期准备。