1背景与目的乳腺癌是全球女性发病率最高的恶性肿瘤,越来越多的研究表明乳腺癌的发病率以及致死率在持续上升。乳腺癌的远处转移被证实是导致治疗失败的主要原因。寻找新的治疗靶点对于乳腺癌的诊断和治疗非常重要。Golgi phosphoprotein 3(GOLPH3)及其相互作用蛋白是肿瘤研究的一个热点。GOLPH3又名GMx33或GPP34,是一个高度保守的高尔基体跨膜蛋白,也是再循环、糖基化、蛋白质在高尔基体与血浆基质交流的重要蛋白。在最近的研究中发现,不只是在高尔基体的形态学以及转运方面发挥作用,GOLPH3更是一个肿瘤基因,其表达通常促进肿瘤的行成和转移。有文献报肿瘤基因GOLPH3促进肿瘤转移和增殖是通过激活Wnt通路、NF-kB通路、mTOR通路或上调MMP2和MMP9表达完成的。Qin Zhang在其研究中指出,在膀胱癌患者中,GOLPH3的高表达促进肿瘤增殖和转移。其他学者在肺癌、直肠癌、前列腺癌和卵巢癌、肝癌和肾上皮癌的研究中也发现了这样的现象。在最近的研究报道中,Zhaolei Zeng及其同事也发现在乳腺癌中发现GOLPH3高表达,并且促进乳腺癌的转移和增殖。本研究将首先通过荧光定量PCR、免疫组化以及蛋白质印记方法检测GOLPH3在乳腺癌组织、癌旁正常组织以及良性肿瘤乳腺纤维腺瘤中的表达情况,明确其在乳腺癌中的表达。同时分析GOLPH3在乳腺癌细胞株中的表达并明确表达差异性。再分析GOLPH3与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、分子分型、手术方式等临床基线特征的关系,明确GOLPH3在乳腺癌诊断中的意义。在明确GOLPH3的临床意义之后我们将选择2株乳腺癌细胞,在体外实验层面下调GOLPH3表达,并通过transwell侵袭迁移实验、CCK-8实验以及细胞流式技术研究GOLPH3表达在乳腺癌中所扮演的角色。之后我们将探讨GOLPH3对乳腺癌患者预后的影响。并且将分亚层研究在不同GOLPH3表达情况下,分子分型,年龄,肿瘤浸润深度,淋巴结转移和手术方式与预后的关系。最后,我们将关注本次研究中所有接受过新辅助化疗和术后辅助化疗的患者,研究GOLPH3表达对乳腺癌化疗效果会有怎样的影响。2方法2.1应用TaKaRa试剂盒提取乳腺癌组织、癌旁组织和纤维腺瘤以及细胞的总RNA,应用qPCR方法检测GOLPH3 mRNA在乳腺癌组织、癌旁组织和纤维腺瘤以及细胞的表达情况,应用免疫组化技术检测GOLPH3蛋白在乳腺癌组织、癌旁组织和纤维腺瘤以及细胞的表达情况,并分析其与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、分子分型和手术方式等基线特征的相关性。2.2设计GOLPH3 siRNA干扰序列,转染乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231;荧光定量PCR检测和western blotting实验验证转染效果。Transwell侵袭迁移实验验证不同乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力;CCK-8法检测GOLPH3对乳腺癌细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测GOLPH3对乳腺癌细胞凋亡的影响。2.3使用SPSS22.0软件。采用cox模型进行单因素统计分析及多因素统计分析,log-rank检验分析生存曲线。2.4化疗方案及治疗策略在249例病例中,有54例术前接受了新辅助化疗。这54位病人所接受的化疗方案我们分为3组。第一组为蒽环类药物联合紫衫类药物以及环磷酰胺,接受该方案的有22位病人;第二组为5-氟尿嘧啶联合蒽环类药物以及环磷酰胺,接受该方案的有20位病人;第三组为其他化疗方案,接受该方案的有12位病人。在249例病例中,有216例接受了术后辅助化疗。我们把这216例患者分为了4组。第一组为蒽环类药物联合环磷酰胺再序贯紫衫类药物,接受该方案的有74位病人;第二组为5-氟尿嘧啶联合蒽环类药物以及环磷酰胺,接受该方案的有79位病人;第三组蒽环类药物联合紫衫类药物,接受该方案的有30位病人;第四组为其他化疗方案,接受该方案的有33位病人。2.5统计数据及分析实验数据结果中的计量资料若服从正态分布,则均以均数士标准差(xˉ±s)表示,采用SPSS22.0软件分析,组间比较采用两样本t检验或单因素方差分析,计数资料采用c~2检验,当样本量小于6时采用Fisher确切概率法。检验水准为α=0.05,以P﹤0.05具有统计学意义,P﹤0.01具有显著差异。3结果3.1 GOLPH3在组织与细胞中的表达免疫组化及蛋白质印记结果表明癌组织中GOLPH3表达远高于癌旁组织和纤维腺瘤(p<0.05),纤维腺瘤和癌旁组织中的表达没有统计学差异(p>0.05)。qPCR检查也得到与上述相同的结果。并且根据免疫组化染色的结果,GOLPH3的表达可以分为+,++和+++。除此之外,我们发现GOLPH3的表达随着淋巴结转移以及TNM分级的增加而增加。之后我们用荧光定量PCR和蛋白质印记实验检测了乳腺癌细胞株中GOLPH3的表达情况,结果显示在2株乳腺癌细胞株中GOLPH3均有表达,其在侵袭性更强的MDA-MB-231细胞中表达高于低侵袭性细胞MCF-7。3.2在乳腺癌细胞中抑制GOLPH3的表达可降低乳腺癌细胞的侵袭迁移以及增殖能力,同时增加乳腺癌细胞的凋亡siRNA干扰序列并转染至MCF-7和MDA-MB-231细胞株中,QPCR及WB检测了转染的效果,证实转染之后两种细胞中GOLPH3表达均下调。与未行转染的亲代细胞以及转染阴性对照序列的scram-siRNA组相比,GOLPH3-siRNA组的侵袭迁移能力、增值能力有明显下降、凋亡增加。3.3过表达GOLPH3导致患者预后不佳GOLPH3的表达与T分期(p=0.033)、N分期(p=0.000)和M分期(p=0.000)、分子分型(p=0.012)以及手术方式(p=0.000)之间有着密切的关系。与GOLPH3低表达患者相比,高表达患者的DFS以及OS都较差。单因素统计分析和多因素统计分析认为GOLPH3的表达是乳腺癌患者DFS和OS的独立影响因素。GOLPH3的表达与乳腺癌的分子分型相关(p=0.012)。在5种分子分型中,GOLPH3的高表达均预示着较差的DFS和OS。然而,对于GOLPH3的低表达的患者而言,DFS以及OS在五种分子分型之间比较没有统计学差异(DFS:p=0.7547,OS:p=0.4734),高表达的患者也是如此(高表达DFS:p=0.6979,OS:p=0.6527)。3.4年龄、肿瘤浸润深度、淋巴结转移对不同GOLPH3表达乳腺癌患者预后的影响对于<40岁的患者,GOLPH3的高表达不会增加复发风险(p=0.5659),但高表达患者的OS差于低表达患者(p=0.0187)。在其他年龄段患者中,GOLPH3的高表达均预示着较差的DFS和OS。在GOLPH3低表达患者中,各年龄组之间的DFS和OS相比无统计学意义。对于GOLPH3高表达的患者而言,复发风险随着年龄的增加而增加,高表达组的OS没有统计学差异。我们观察到在T1和T2期患者中,GOLPH3过表达会导致较差的DFS和OS(T1:DFS:p=0.0103,OS:p=0.0101,T2:DFS:p<0.0001,OS:p<0.0001)。而对T3和T4患者,GOLPH3的高低表达对预后的影响无统计学意义(T3:DFS:p=0.1389,OS:p=0.1270,T4:DFS:p=0.1203,OS:p=0.4716)。在GOLPH3高表达的患者中,T3和T4分期预示着较差的DFS(p=0.0360),而对OS则无影响(p=0.7521)。在GOLPH3低表达的患者中,随着肿瘤浸润深度的增加,患者的预后会越来越差DFS(p=0.0186)、OS(p=0.0222)。对于没有淋巴结转移的患者(N0)而言,GOLPH3过表达提示预后不佳DFS(p=0.0004)and OS(p=0.0166)。在有淋巴结转移的患者中,GOLPH3的表达对DFS和OS的影响则不大(N1:DFS:p=0.3957,OS:p=0.6825,N2:DFS:p=0.4373,OS:p=0.6775)。在GOLPH3低表达患者中,淋巴结转移数目的多少与复发风险的高低相关DFS(p<0.0001),但与总生存率关系不大OS(p=0.3053)。在高表达患者中,淋巴结转移数目越多预后越差DFS(p=0.0012)and OS(p<0.0001)。3.5手术方式对GOLPH3高表达患者的预后影响不大在入组的患者中,分别接受过保乳术、乳房单纯切除术、改良根治术以及局部切除术。在接受保乳术的患者中,GOLPH3低表达的有17位,高表达的只有1位,因为样本量较少,所以DFS和OS的结果无法完全展示GOLPH3的表达在保乳术中对患者预后的影响,同样的结果也可以在接受乳房单纯切除术和局部切除术的患者中看到。在接受改良根治术的患者中,GOLPH3的高表达会导致较差的DFS和OS。在GOLPH3低表达的这类患者中,接受不同手术方式的患者最终的DFS和OS并无统计学差异。在高表达GOLPH3的患者中,虽然各手术方式之间的比较结果显示DFS和OS都有统计学差异(DFS:p=0.0240,OS:p=0.0182),但我们认为是样本量较少所致的结果,这样的结果有一定的偶然性。3.6在乳腺癌患者中,GOLPH3的高表达会导致新辅助化疗效果不佳,在本次研究中,有54位患者接受过新辅助化疗。其中36位患者的GOLPH3呈高表达,他们化疗之后的部分缓解率低于另外18位低表达患者的部分缓解率(p=0.021)。在这54位患者中,22位接受了蒽环+紫衫+环磷酰胺方案,20位接受了氟尿嘧啶+蒽环+环磷酰胺方案,12位接受了其他方案。在接受蒽环+紫衫+环磷酰胺这组患者中,14位患者GOLPH3高表达,他们的部分缓解率(6/14)低于另外8位低表达患者的部分缓解率(7/8)(p=0.05)。在接受氟尿嘧啶+蒽环+环磷酰胺方案和其他方案组的患者中,GOLPH3的表达对DFS以及OS无影响(p=0.492,p=0.296)。3.7在接受术后辅助化疗的患者中,GOLPH3高表达易导致肿瘤高复发率有216位患者接受了术后辅助化疗。在这216位患者中,103位GOLPH3高表达的患者DFS和OS较113位低表达的患者差(DFS:p<0.0001,OS:p<0.0001)。在这部分接受了化疗的患者中,74位接受了蒽环联合环磷酰胺序贯紫衫方案的治疗,在这些患者中,GOLPH3高表达的患者较低表达患者相比更容易复发(p=0.035),总生存率也更差(p=0.0015)。同样的结果也展示在79位接受氟尿嘧啶+蒽环+环磷酰胺方案的患者中(复发率p=0.010),总生存率(p=0.0017)。但是,在30位接受紫衫+环磷酰胺的患者中,GOLPH3的表达与复发率及总生存率无统计学意义(复发p=0.190,OSp=0.2129)。在接受其他化疗方案的患者中,过表达GOLPH3导致高复发风险(p=0.027),但总生存率无统计学意义(p=0.0845)。4结论4.1 GOLPH3在乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织及乳腺纤维腺瘤。GOLPH3的表达量与乳腺癌T分期、N分期、M分期、分子分型以及手术方式之间有着密切的关系。GOLPH3是一个具有诊断价值的癌基因。4.2下调GOLPH3表达抑制乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231的侵袭和迁移能力。下调GOLPH3表达抑制乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231的增殖能力。下调GOLPH3表达使乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231的细胞凋亡率增加。4.3高表达GOLPH3的乳腺癌患者预后不佳。GOLPH3是一个影响预后的独立因素。在各分子分型中高表达GOLPH3的乳腺癌患者预后不佳。对于<40岁的患者,GOLPH3的高表达不会增加复发风险,但高表达患者的OS差于低表达患者。在其他年龄段患者中,GOLPH3的高表达均预示着较差的DFS和OS。对于GOLPH3高表达的患者而言,复发风险随着年龄的增加而增加。在T1和T2期患者中,GOLPH3过表达会导致较差的DFS和OS。在GOLPH3高表达的患者中,T3和T4分期预示着较差的DFS,而对OS则无影响。在GOLPH3低表达的患者中,随着肿瘤大小的增加,患者的预后会越来越差。对于没有淋巴结转移的患者(N0)而言,GOLPH3过表达提示预后不佳DFS和OS。在GOLPH3低表达患者中,淋巴结转移数目的多少与复发风险的高低相关,但与总生存率关系不大。在高表达患者中,淋巴结转移数目越多预后越差。手术方式的选择对GOLPH3高表达患者的预后影响不大。4.4 GOLPH3高表达患者接受新辅助化疗之后的部分缓解率低于GOLPH3低表达患者。接受蒽环+紫衫+环磷酰胺新辅助化疗方案的患者中,GOLPH3高表达患者的部分缓解率低于低表达患者。接受术后辅助化疗的患者中,GOLPH3高表达患者DFS和OS较低表达的患者差。接受蒽环联合环磷酰胺序贯紫衫方案以及氟尿嘧啶+蒽环+环磷酰胺方案的患者中,GOLPH3高表达的患者较低表达患者相比更容易复发,总生存率也更差。创新点1.我们在大样本中探讨了GOLPH3表达对乳腺癌患者预后的影响。并且细分亚层研究在不同GOLPH3表达情况下,分子分型,年龄,肿瘤浸润深度,淋巴结转移和手术方式与预后的关系。该研究结论未见文献报道。2.我们研究了GOLPH3对乳腺癌新辅助化疗疗效的影响以及GOLPH3对术后辅助化疗疗效的影响以及治疗方案的选择。该研究结论未见文献报道。