DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分,在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育及人类肿瘤发生中起着重要的作用。肿瘤细胞中的DNA甲基化控制失常,以致基因中散在的CpG位点甲基化普遍降低(促使原癌基因表达),同时出现染色体区域性CpG岛高甲基化(抑癌基因抑制)。异常DNA甲基化通常发生在CpG成簇组成的CpG岛,通常位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点。近年来,关于DNA甲基化在肿瘤的诊断、治疗及预后等方面的作用及意义的研究正深入展开。 随着对甲基化研究的深入,各种各样的甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型的研究要求。基于生物芯片甲基化的检测方法为高通量DNA甲基化检测提供了技术平台和基础。本论文旨在进一步探讨基于生物芯片的快速、便捷、低成本、高通量的DNA甲基化检测方法。具体内容如下： 一.基于亚硫酸氢盐修饰的DNA甲基化检测 1.在片延伸DNA甲基化检测技术 在基因启动子区域的CpG位点异常甲基化已经被证实与肿瘤的发生有着很重要的联系。我们探讨了用在片等位特异延伸的方法来检测DNA甲基化状态。gDNA经亚硫酸氢盐修饰后,先通过PCR的方法获得目的片段,然后用外切酶将把片段制成单链,再与芯片上固定的引物杂交,最后通过Taq酶来等位特异延伸上Cy5标记的dGTP,这样就可以分析出特定CpG位点的甲基化状态。为了控制试验过程中的假阳性信号,我们对杂交环境、DNA聚合酶及引物做了一定的优化。在这项试验中,我们用这种方法成功分析了乳腺癌相关的两个基因(P16基因和E-cad基因),并且所有的结果都通过经典的methylation-specific PCR(MSP)方法得到了验证。这些试验结果表明这种基于芯片的方法可以作为一种高通量的工具用于肿瘤相关基因的甲基化状态的分析。 2.基于芯片甲基化敏感性单碱基延伸DNA甲基化检测技术 在上面研究的基础上我们发展了基于生物芯片的甲基化敏感性单碱基延伸DNA甲基化检测的方法。gDNA经亚硫酸氢盐修饰后,先通过PCR的方法获得目的片段,纯化后作为CpG位点特异引物的模版,在Therminator DNA聚合酶的作用下,通过PCR循环的方式延伸单个荧光标记的Cy5-dCTP或Cy3-dUTP。我们成功地分析了乳腺癌相关的两个基因(P16基因和E-cad基因)中的22个CpG位点的甲基化状态,并且通过经典的MSP方法验证了相关的结果。研究结果表明,这种基于芯片的方法可以作为一种高通量的工具用于肿瘤相关基因的甲基化状态的分析,并且与前一项技术相比,该技术在成本、操作简单、结果的精确性等方面有更大的优势。 二.基于甲基化敏感性内切酶处理的DNA甲基化检测 Anders O.H.等2005年改进MLPA为Ms-MLPA用于检测特异位点的甲基化。我们旨在将生物芯片的优势引入到MS-MLPA中,探讨一种基于生物芯片的Ms-MLPA。针对被检测的甲基化DNA,设计和合成了两个寡核苷酸部分,其中一个部分含有一个大约20bp左右的密码区(Tag区),可与通用芯片上特定序列的寡核苷酸探针互补杂交。探针的两个寡核苷酸杂交序列均与目标序列互补,其末端都连有相同的PCR引物。且要求设计的MS-MLPA的探针要有甲基化敏感的限制性内切酶BstUI(CGCG)的识别位点。经探针和目标序列杂交后,降低反应体系温度,并向其中加入连接酶和BstUI,若原样本DNA中含有BstUI识别的非甲基化的位点,则非甲基化探针的两个寡核苷酸部分不能连接,而甲基化的探针顺利连接不被切割,在随后的PCR反应中只有两个寡核苷酸部分连接后的探针才能被扩增。最后通过芯片分析扩增片段,确定待研究位点的甲基化情况。在这项技术中所有的探针均通过合成的方法获得大大提高了实验的通用性、缩短试验周期、降低实验成本。这种技术因其简单,廉价和快速可以被广泛的应用于各种需要检测DNA甲基化的生物医学领域。