目的:1992及2002年中国居民营养与健康状况调查报告显示，我国居民膳食钙的平均摄入量分别为405.4 mg/d及390.6 mg/d，仅为推荐摄入量的50％左右。钙补充剂被广泛用于改善居民膳食钙摄入不足的问题，尤其是针对绝经后女性，补钙被认为是防治骨钙流失和骨质疏松的有效手段。我国居民补钙已进行约30年，然而补钙对我国居民健康产生怎样的影响目前尚无明确报道。我们课题组在对补钙与居民慢性病相关性的大规模人群研究中发现补钙绝经后女性补钙与心肌梗死、高胆固醇血症等心血管疾病(CVD)事件的发生呈显著正相关。此外，国外近年人群研究也显示补钙可增加绝经女性CVD的发病风险。补钙是关系我国公共健康的重要因素，其可能导致的任何风险都应引起我们足够的重视并有必要进行深入研究。然而，由于人群研究手段的限制，补钙影响绝经女性CVD事件的病理机制尚不清楚。绝经女性由于体内雌激素水平显著下降导致血中总胆固醇及炎性因子水平显著上升。血中胆固醇水平升高是CVD发生的独立风险因素;此外，炎性因子介导的血管内皮损伤也是导致动脉粥样硬化(AS)及CVD的重要病因。因此，本研究将对雌激素缺乏状态下补钙对肝脏内源性胆固醇代谢以及血管内皮功能的影响做深入研究并阐明其分子机制，为揭示绝经女性补钙对CVD发生的影响奠定科学基础。　　方法:本研究采用动物实验以及体外细胞实验相结合的技术手段分别对雌激素缺乏状态下补钙对内源性胆固醇的代谢以及血管内皮细胞功能的影响进行研究，并采用分子生物学技术手段及其机制进行深入研究。(1)补钙对雌激素缺乏状态下内源性胆固醇代谢的研究:在动物实验中，我们分别对雌性Wistar大鼠进行了卵巢切除术及假手术处理，其中卵巢去除组大鼠用于模拟女性绝经后生理状态。然后分别将卵巢去除组及假手术组大鼠分为正常膳食钙及高钙组进行为期12周的干预研究。实验结束后采用全自动生化分析仪对血清、肝脏及粪便中的理化指标进行检测。同时，采用荧光定量PCR及Western Blotting技术对肝脏中参与调节胆固醇代谢的关键靶点的mRNA及蛋白水平进行检测。此外，分别应用激光共聚焦显微镜及酶联免疫吸附实验对肝脏中的细胞内钙及cAMP水平进行检测;在体外研究中我们选择了人肝癌细胞系(HepG2)作为研究对象，分别给予雌二醇和/或不同剂量细胞外钙以研究胆固醇的代谢情况，并对调节胆固醇代谢的分子靶点的mRNA及蛋白水平进行检测。采用siRNA基因沉默技术或信号通路阻断剂分别对靶点基因或信号通路进行阻断;同时，采用基因过表达技术及信号通路激动剂分别激活靶点基因或信号通路，以阐明补钙调解胆固醇代谢的信号传导通路及分子靶点。对实验动物给予G蛋白偶联雌激素受体(GPER)特异性激动剂G1进行干预，以验证雌激素保护补钙引起的胆固醇升高的分子机制。(2)补钙对雌激素缺乏状态下血管内皮细胞功能的研究:在动物实验中，我们分别对雌性c57bl/6小鼠进行了卵巢切除术及假手术处理，然后分别将卵巢去除组及假手术组小鼠分为正常膳食钙及高钙组进行为期16周的膳食干预。干预后采用ELISA试剂盒对血浆血管细胞粘附因子-1(VCAM-1)、肿瘤坏死因子-alpha(TNF-alpha)、白介素-1beta(IL-1beta)等指标进行检测。通过免疫组化技术对血管内皮细胞VCAM-1的表达进行检测。在体外研究中，选择人原代脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人脐静脉细胞融合细胞(Ea.hy926)作为研究对象，给予不同浓度细胞外钙及TNF-alpha对细胞粘附因子的表达进行分析。通过荧光定量PCR及Western Blotting技术对血管内皮细胞的VCAM-1及其调控靶点的mRNA及蛋白水平进行检测。通过荧光探针技术并采用激光共聚焦显微镜或倒置荧光显微镜对细胞内一氧化氮、活性氧、钙离子浓度等指标进行检测。采用人单核细胞株U937对钙协同TNF-alpha刺激的单核细胞粘附水平进行检测。采用基因转染技术分别对目标基因进行沉默或过表达干预;同时采用信号通路的特异性激动剂或抑制剂对分子信号传导通路进行干预，以阐明补钙协同炎性因子调节血管内内皮细胞粘附因子表达的分子机制。采用慢病毒包被的shRNA质粒对动物体内TRPC1进行沉默，同时采用U0126对动物体内ERK1/2活性进行抑制，进一步验证其分子信号传导机制。　　结果:(1)补钙对雌激素缺乏状态下内源性胆固醇代谢的研究结果:动物实验结果表明，雌激素缺乏状态下补钙显著增加血中总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇水平;在雌激素正常状态下补钙对血中胆固醇水平无显著影响。此外，补钙显著增加了雌激素缺乏状态下肝脏中总胆固醇的水平，并减少了粪便中胆汁酸的排出量。分子生物学检测结果显示雌激素缺乏状态下补钙显著抑制了胆固醇分解代谢的关键酶胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)的mRNA及蛋白表达，而对关键合成酶羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶的表达无显著影响。在体外实验中我们也得到了相同的结果。上述结果表明在雌激素缺乏状态下，补钙引起的血中总胆固醇水平上升主要是由于胆固醇分解代谢受到抑制而非影响胆固醇的合成代谢。随后的体内外研究结果表明，在雌激素缺乏状态下，补钙通过上调肝细胞瞬时受体电位通道蛋白1(TRPC1)增加细胞内钙离子浓度导致胞内cAMP水平下降，进而上调固醇调节元件结合蛋白-1c以及微小异源二聚体伴侣的表达，从而降低CYP7A1的表达抑制胆固醇的分解代谢。在正常生理状态下，雌激素通过激活GPER调节TRPC1防止了补钙引起的细胞内钙水平的升高及最终导致的血清总胆固醇水平的增加。(2)补钙对雌激素缺乏状态下血管内皮细胞功能的研究结果:与假手术组动物相比，卵巢去除组动物血浆中炎性因子(TNF-alpha、IL-1beta)水平显著升高。补钙显著升高了卵巢去除组小鼠的血浆及血管内皮的VCAM-1的水平，而在假手术组内，补钙对小鼠血浆及血管内皮的VCAM-1的水平无显著影响。体外研究结果表明，在雌激素缺乏状态下，单纯增加细胞外钙浓度仅引起VCAM-1的mRNA水平的显著升高，而对其蛋白表达无显著影响;然而增加细胞外钙浓度可通过协同TNF-alpha显著刺激VCAM-1的mRNA及蛋白的表达，并显著增加单核细胞的粘附数量。增加细胞外钙显著增加了血管内皮细胞内钙离子的水平，而对细胞内一氧化氮、活性氧及环磷酸腺苷的水平无显著影响。随后的机制研究表明，在雌激素缺乏状态下补钙通过上调TRPC1的表达增加血管内皮细胞内钙浓度，增加的细胞内钙通过激活细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)导致NFκB的激活进而协同TNF-alpha增加VCAM-1的表达。　　结论:在雌激素缺乏状态下，补钙通过抑制肝脏胆固醇的分解代谢导致血中总胆固醇水平的上升;此外，补钙通过协同炎性因子增加了血管内皮细胞VCAM-1的表达。在正常雌激素水平状态下，补钙对肝脏胆固醇代谢及血管内皮细胞中VCAM-1的表达均无显著影响。因此，雌激素缺乏状态下补钙可能通过增加血中总胆固醇含量及血管内皮粘附因子的表达进而增大AS及CVD的发病风险。