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研究背景：糖基化磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）锚定蛋白质是真核生物细胞质膜上非常重要的一类膜蛋白。GPI特异性磷脂酶D（GPI-PLD）能选择性地水解GPI锚定蛋白质中的肌醇磷酸酯键，释放出锚定蛋白，影响GPI锚定蛋白质的表达和生物学功能。该酶活性可受多种因素，包括脂多糖、氧化剂、葡萄糖和胰岛素等的影响和调控。肝脏、胰腺和骨髓是人血浆GPI-PLD的重要来源。本课题组已经从人骨髓基质细胞中克隆出GPI-PLD完整cDNA（长度2.6kb，GenBank accession number AY007546），这为进一步研究GPI-PLD创造了条件。GPI锚定蛋白质如CD55、CD59等是重要的免疫分子，T淋巴细胞的活化和增殖也涉及到富含GPI锚定蛋白、胆固醇、鞘糖脂、G蛋白和PTK的脂微区来实现信号转导。GPI锚定蛋白质结构的完整性对其发挥生理活性很重要，例如GPI锚定的CD55、CD59水解成可溶形式后，水溶性CD59的功能就不完全，抑制补体的能力下降。慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）是造血组织的一种恶性肿瘤，其白血病细胞BCR-ABL融合基因表达的产物属src癌基因家族，具有PTK激酶活性。已经有报道提示白血病细胞的某些GPI锚定蛋白质的表达和功能都可能存在异常。对一些白血病细胞株如K562、HL-60、U937等检测发现，它们均可表达GPI-PLD，但其表达水平都非常低，而且不同细胞株表达的水平有差异。因此，白血病细胞中GPI锚定蛋白和GPI-PLD水平变化与白血病的发生和发展可能有一定的联系。为了研究CML患者GPI-PLD和GPI锚定CD55、CD59的表达水平以及它们之间的关系，GPI-PLD和GPI锚定蛋白质在CML发病中可能的分子机制，白血病K562细胞株的GPI-PLD活性和表达水平是否会影响到免疫系统对它的杀伤作用，以及GPI-PLD与肿瘤免疫逃逸是否有密切联系，研究者设计本实验，初步探讨和解决这些问题。方法：1．应用竞争性定量RT-PCR技术确定正常人和CML患者外周血单个核细胞中GPI-PLD mRNA的表达水平，采用我室自制的具完整GPI结构的胎盘型碱性磷酸酶（PLAP）作底物测定正常人和CML患者GPI-PLD的酶活性，流式细胞术分析外周血单个核细胞表面GPI锚定CD55和CD59的表达水平，Western-Blotting结合TX-114分相技术检测GPI-PLD对GPI锚定CD55和CD59的释放。2．采用基因克隆技术构建GPI-PLD cDNA真核表达载体，脂质体转染K562细胞，G418筛选稳定转染、过度表达GPI-PLD的阳性克隆细胞株，通过检测GPI-PLD mRNA的表达水平和酶活性以及对GPI锚定CD55和CD59的释放，确定基因转染是否成功。3．用胰岛素作为诱导剂分别对野生型K562细胞株和稳定转染GPI-PLD基因阳性克隆的K562细胞株进行诱导试验，观测GPI-PLDmRNA的表达水平、酶活性和GPI锚定CD55、CD59的释放变化。4．台盼蓝排斥法观测K562细胞GPI-PLD水平改变对补体介导的细胞毒作用的杀伤率变化，MTT比色法判断T淋巴细胞对K562细胞在不同GPI-PLD水平时的杀伤率。结果：1．检测110名正常人和80例CML患者，发现CML患者外周血单个核细胞和血浆中GPI-PLD活性水平（均以释放GPI锚定的PLAP的百分率表示）的平均值（x±s）为21.2±2.8％与28.9±3.6％，显著性低于正常人的水平（相应为41.7±3.8％和41.9±4.5％），其单个核细胞和血浆中酶活性水平减少的幅度分别为100％和70％（P＜0.001）。进一步分析发现，CML患者单个核细胞GPI-PLD活性仅为其血浆中酶活性水平的75％（P＜0.001），但正常人单个核细胞和血浆中GPI-PLD酶活性水平无显著性差异（P＞0.05）。2．竞争性定量RT-PCR方法检测20名正常人和20例CML患者的GPI-PLD mRNA的表达水平。结果表明，正常人和CML患者外周血单个核细胞GPI-PLD mRNA表达水平的平均值（x±s）相应为1.237×103±42拷贝／ng总RNA和0.438×103±30拷贝／ng总RNA，正常人GPI-PLD mRNA表达水平显著性高于CML患者（P＜0.001），大约为其3倍。其中6例CML患者经骨髓移植治疗成功后，GPI-PLD活性和mRNA表达水平均基本恢复至正常人的水平。3．流式细胞术分析20名正常人和40例CML患者，发现其外周血单个核细胞GPI锚定CD55和CD59分子均显示阳性，但其荧光强度的数值范围正常人较CML患者要弥散一些。正常人CD55和CD59分子的荧光强度值范围相应在330.7至673.8和545.6到782.4；CML患者其数值范围相应在438.8至478.6和641.2到704.6；CML患者单个核细胞表面CD55和CD59表达水平的平均值（x±s）相应为537.2±25与747.9±35，正常人相应为458.0±13与677.4±19，CML患者这两种分子的表达水平都显著性高于正常人（P＜0.05）。4．成功构建了GPI-PLD cDNA的真核细胞表达载体pcDNA3.1（+）／GPI-PLD，筛选到了稳定高表达GPI-PLD活性的K562细胞株。阳性克隆细胞株的GPI-PLD活性和mRNA表达水平比阴性包括空载体阳性对照组K562细胞都相应提高了约6和7倍，功能鉴定还显示阳性克隆细胞表面的GPI锚定CD55和CD59分子数量均显著性减少，仅为对照组的一半。5．用10-7mol／L浓度的胰岛素诱导野生型K562细胞株24h和48h，可导致诱导细胞的GPI-PLD mRNA表达水平和GPI-PLD活性水平同步增高4倍和7倍；诱导稳定转染型K562细胞株24h和48h，可使它们在原有高表达水平上再增高约10％和20％。6．Western-Blotting结合TX-114分相技术检测野生型K562细胞和稳定转染型K562细胞，经胰岛素诱导后，发现其细胞内的GPI-PLD活性水平不同，保留在细胞膜上的GPI锚定型CD55和CD59的量，以及出现于细胞培养液中的水溶性CD55和CD59的量也不同，这证明释放反应由GPI-PLD催化实现。7．胰岛素诱导24h和48h后，野生型K562细胞的补体杀伤率由诱导前的6.44±0.22％显著性增高到12.19±0.14％和18.79±0.42％，增高的百分率分别为189％和293％；阳性克隆K562细胞经胰岛素诱导24h和48h后，其补体杀伤率也在原有高杀伤率（18.40±0.41％）基础上显著性增高到20.87±0.70％和25.28±0.26％，增高的百分率分别为112％和137％。而且，GPI-PLD酶活性与补体介导的细胞毒杀伤率成正相关，相关系数为0.975。8．胰岛素诱导24h和48h后，野生型K562细胞被T淋巴细胞的杀伤率由诱导前的8.45±0.32％显著性增高到26.77±0.37％和32.70±0.43％，增高的百分率分别为316％和507％；阳性克隆K562细胞经胰岛素诱导24h和48h后，其T淋巴细胞杀伤率也在原有高杀伤率（36.81±0.31％）基础上显著性增高到43.72±0.12％和49.30±0.28％，增高的百分率分别为119％和133％。GPI-PLD酶活性与T淋巴细胞的杀伤率也成正相关，相关系数为0.959。结论：1．首次报道CML患者白血病细胞GPI-PLD活性和表达水平比正常人显著性减少，经骨髓移植治疗成功后，两者可恢复至正常人的水平；白血病细胞膜上GPI-PLD活性低下可导致细胞表面GPI锚定CD55和CD59的数目显著性增加。2．首次成功建立稳定高表达GPI-PLD cDNA的白血病K562细胞株。3．发现胰岛素诱导K562细胞株可导致GPI-PLD基因过度表达及GPI-PLD活性显著性增加，与此同时，细胞表面GPI锚定CD55和CD59的分子数量均显著性减少，细胞被补体和T淋巴细胞的杀伤率都相应增加。4．首次阐述和证实GPI-PLD参与了CML发病的分子机制，它与肿瘤的免疫逃逸也密切相关。