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背景：颞叶癫痫是成人难治性癫痫发作的主要类型之一,如何对其进行预防和更为有效的治疗,对癫痫的基础与临床研究提出了挑战。离子通道的表达及功能障碍在癫痫特别是难治性癫痫的病因和发病机制中占据重要地位,其中钾通道基因突变与癫痫发作的关系已经在某些癫痫发作类型中得到证实。内向整流钾通道(Inwardly rectfying K+ channels,Kir)是钾通道中的一大类,主要起到维持静息膜电位和调节神经元兴奋性的作用。痫性发作可能与Kir通道的功能和(或)表达异常有关。Kir通道亚家族成员众多,其中Kir2.3通道亚单位在皮层及海马均有表达。目前已发现难治性颞叶癫痫患者海马Kir2.3通道mRNA及蛋白表达水平均有明显下降,因此Kir2.3通道可能是难治性癫痫发生与发展相关的重要分子学基础之一。
目的：建立慢性颞叶癫痫大鼠模型,分析致痫后不同时间点海马组织中Kir2.3通道mRNA及其蛋白的表达变化,探讨Kir2.3通道在颞叶癫痫发病机制中的地位与可能关系;分析Kir2.3通道特异性开放剂替尼达普对慢性颞叶癫痫大鼠行为学、Kir2.3通道mRNA和蛋白表达变化的影响,为在临床上应用钾通道开放剂作为抗癫痫药物提供依据。
材料与方法：匹罗卡品诱发大鼠产生癫痫持续状态(Status epilepticus,SE),经过2周左右出现自发性复发性癫痫(spontaneous recurrent seizures,SRS)后成模为慢性颞叶癫痫大鼠。以SE终止后0h、6h、72h和2周作为时间点,分别用RT-PCR和Western Blot方法检测致痫大鼠和对照组大鼠海马中Kir2.3通道mRNA及其蛋白的表达变化;然后,给致痫大鼠腹腔注射替尼达普,观察给药与否对慢性颞叶癫痫大鼠行为学变化的影响,并同样用RT-PCR和Western Blot方法检测给药与否对SE后2周大鼠海马Kir2.3mRNA和蛋白变化的影响。
结果：1.匹罗卡品致痫后,大鼠呈现典型的三期行为学变化:急性期,表现为癫痫持续状态,20-95 min(平均48 min)时出现Ⅳ或Ⅴ级持续性发作;经地西泮终止癫痫发作后,进入相对静息的潜伏期;慢性期,出现自发性复发性癫痫发作。SE大鼠成模率94.6％,死亡率6.6％。经SE60min后,存活大鼠在5天到2周时均已出现自发性复发性发作,表明慢性颞叶癫痫大鼠造模成功,SRS成模率93.4％;RT-PCR结果显示,SE终止后0h、6h、72h、2w各时间点Kir2.3mRNA/β-actin比值分别为0.103±0.045、0.164±0.026、0.132±0.024、0.011±0.008。与对照组(0.080±0.030)比较,发作后即刻(0h)Kir2.3mRNA的表达即有升高趋势,6h时升高更加明显,其增高差异具有统计学意义(P＜0.05),72h时Kir2.3mRNA的表达仍较对照组高,但与6h高峰时相比已有下降趋势。当致痫大鼠出现自发性复发性癫痫后,即2w组大鼠其Kir2.3mRNA表达明显下降,与对照组比较亦具有统计学意义(P＜0.05)。Western Blot结果显示,各时间点Kir2.3/GAPDH比值分别为0.263±0.028、0.767±0.167、0.498±0.077、0.176±0.026。与对照组(0.305±0.030)比较,6h时蛋白表达明显升高(P＜0.05),2w时表达下降并具有统计学意义(P＜0.05),与RNA变化趋势基本相符;
2.替尼达普给药后,在35-73min(平均54min)后出现持续性Ⅳ-Ⅴ级癫痫发作,达到SE的潜伏期较未给药组有所延长,大鼠激惹情况好转。RT-PCR结果表明,对照组、替尼达普未给药组和给药组慢性颞叶癫痫大鼠海马Kir2.3mRNA/β-actin比值分别为0.080±0.030、0.011±0.008和0.021±0.006。与对照组相比,替尼达普未给药的大鼠海马Kir2.3mRNA在2w时表达明显下降(P＜0.05);替尼达普给药组大鼠海马Kir2.3mRNA表达升高,与未给药组相比具有统计学差异(P＜0.05)。Western Blot结果显示,对照组、替尼达普未给药组和给药组大鼠海马Kir2.3蛋白/GAPDH比值分别为0.305±0.030、0.176±0.026和0.636±0.140。与对照组相比,替尼达普未给药的大鼠海马Kir2.3蛋白在2w时表达明显下降(P＜0.05);而给药后,大鼠海马的Kir2.3蛋白表达明显升高,与未给药组相比具有统计学差异(P＜0.05),与对照组相比亦有明显升高(P＜0.05)。
结论：1.本研究采用的慢性颞叶癫痫大鼠模型造模较为成功,大鼠行为学改变符合人类颞叶癫痫的发展规律,可应用于实验研究;Kir2.3通道的改变可能倾向于是一个动态变化的慢性过程。急性期Kir2.3mRNA及蛋白表达升高,可能为一应激反应或机体的自我保护机制。当SE发生2周后、即转入慢性自发性癫痫发作时,在大鼠模型中观察到Kir2.3通道的表达下调,这可能是最终导致难治性癫痫反复发作的病理生理学基础之一。我们的结果提示,2周可能是Kir2.3通道表达发生变化的转折点;2.替尼达普通过增加Kir2.3mRNA和蛋白表达,可能使钾离子通道受损的内向整流作用得到一定程度的恢复,缓冲细胞外的钾负荷,维持静息膜电位,最终可能减少痫样放电的产生。这为使用钾通道开放剂作为抗癫痫药物应用于临床提供了实验依据。