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米曲霉是重要的工业酿造菌株,也是较理想的异源蛋白表达宿主。利用基因工程技术,构建米曲霉遗传转化系统如基因工程菌株和高效的外源蛋白表达系统的研究日益受到重视。本研究分别对工业菌株米曲霉3.951和模式菌株米曲霉RIB40的原生质体制备和再生的条件进行了优化,提高了原生质体的得率和再生率。采用PEG-CaCl2法将打靶载体pPGT转化米曲霉3.951原生质体,以5-FOA抗性平板筛,选获得了pyrG基因的缺失菌株。主要研究内容和结果如下：1.米曲霉原生质体的制备和再生条件的优化针对米曲霉3.951和米曲霉RIB40进行原生质体制备条件的研究,比较了制备材料、菌龄、渗透压稳定剂、复合酶配比、酶解时间以及酶解温度对两株菌原生质体形成和再生的影响。结果表明两株米曲霉原生质体制备的最适宜条件稍有差异,其中米曲霉3.951菌株原生质体制备和再生的最适宜条件是：以菌丝为制备材料,菌龄为14h,渗透压稳定剂为0.8M NaCl,复合酶配比为1.0%纤维素酶、1.0%裂解酶、0.1%蜗牛酶,酶解时间为3h,酶解温度为35℃；米曲霉RIB40菌株原生质体制备和再生的最适宜条件是：以菌丝制备材料,菌龄为12h,渗透要稳定剂为0.8M NaCl,复合酶配比是为1.0%纤维素酶、1.0%裂解酶、0.1%蜗牛酶,酶解时间为3h,酶解温度是35℃。在优化条件下米曲霉3.951菌株释放的原生质体达6.43×107个/g,再生率可达23.5%,米曲霉RIB40释放的原生质体可达4.24×107个/g,再生率22.41%。2.营养缺陷型筛选米曲霉pyrG缺失株基于较高的原生质体得率,采用PEG介导的原生质体转化方法将打靶载体pPGT转入米曲霉3.951中。在含5-FOA的抗性筛选平板上得到约1000株转化子,传代7次后获得约600株具有稳定抗性的转化子。表型验证结果显示所有转化子均能在SM和MM培养基上正常生长；PCR验证结果发现仅有8株转化子呈现预期条带(1.5kb)与原始条带(2.0kb)。进一步的Southern杂交分析结果表明有两株转化子(A138和A168)的基因组与打靶载体同源序列发生了同源重组,基因组上的pyrG基因缺失了421bp,成功将米曲霉3.951的pyrG基因失活。