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酵母双杂交系统是近年来发展起来的一种研究蛋白质—蛋白质相互作用的有效方法，由于它检测的是一种体内的相互作用，自这一系统建立以来，就被广泛地应用于生命研究的各个领域。在植物信号转导领域中，利用这一系统筛选到了许多重要的信号分子。鉴于双杂交技术在信号转导领域中的重要作用，我们开始探索建立这一方法。 G蛋白和CaM是植物细胞信号转导中的两个重要的信号组分，它们参与细胞的多种反应，具有重要的生理功能。本文利用酵母双杂交系统分别筛选了与这两种蛋白相互作用的蛋白质，以进一步研究G蛋白和CaM信号转导途径中的其它上下游组分。本工作为我室酵母双杂交方法的建立打下了一个良好的基础。 首先以G蛋白α亚基为诱饵构建了诱饵蛋白表达载体。通过PCR扩增得到GPA1基因并将其克隆到双杂交DNA结合域载体pGBKT7中，得到的重组质粒命名为pGBKT7-Gα，β—半乳糖苷酶活性鉴定表明Gα不具有自激活特性，将其转化到酵母菌pJ69-4A中，再以此为受体菌转化拟南芥绿色营养组织cDNA文库质粒。利用营养缺陷型和β—半乳糖苷酶活性筛选到4个阳性克隆，测序结果表明它们具有相同的序列。到Genbank进行序列比对，结果表明它们编码拟南芥叶绿体碳酸酐酶(CA)基因，编码区含有部分CA序列，从N端第86位氨基酸至C末端，共251个氨基酸。通过RT-PCR克隆了CA编码区全长cDNA，但是在双杂交系统检测全长CA与G蛋白的相互作用时，结果为阴性。之后将成熟CA和文库中筛到的CA编码部分的基因分别亚克隆至双杂交激活域载体pGADT7，进行双杂交检测它们与G蛋白的相互作用，结果仍为阴性。 其次，以拟南芥2号亚型钙调素(ACaM2)为诱饵蛋白对双杂交文库进行了筛选。构建了诱饵蛋白表达载体pGBKT7-ACaM2。鉴定ACaM2不具有自激活后将其转化到酵母菌pJ69-4A中，以此为受体菌转化拟南芥绿色营养组织cDNA文库质粒。利用营养缺陷型和β—半乳糖苷酶活性筛选到2个阳性克隆。测序及序列比对结果表明二者序列相同，为KED样蛋白的部分编码序列，编码部分从N端第240位氨宋林夜:利用酵母双杂交系统筛选与G蛋白及CaM相互作用的新型蛋白基酸至C末端，共207个氨基酸。利用体外转录翻译系统和免疫共沉淀验证了这两种蛋白在体外的相互作用，结果表明KED样蛋白能够在体外与ACaMZ发生相互作用，并且这种作用是c扩+依赖型的。进一步通过RT.pcR克隆了KED样蛋白编码区全长cDNA，通过双杂交验证了全长KED样蛋白与ACaMZ的相互作用，结果为阳性。对这一蛋白的CaM结合域进行了预测，表明KED样蛋白的CaM结合域在其C端。