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脆性X综合征(fragile X syndrome,FXS)是常见的遗传性智力低下疾病之一。FXS的发生是由于脆性X智力低下基因(fragile X mental retardation 1,Fmr1)5’端非编码区(CGG)n三核苷酸重复序列不稳定扩增及其相邻部位CpG岛异常甲基化使Fmr1基因转录失活,导致其编码的产物——脆性X智力低下相关蛋白(fragile X mental retardation protein,Fmrp)表达减少或缺失而引起。临床上主要表现为不同程度的智力低下、注意力缺陷、孤独症及多动症等。Fmrp是一种mRNA结合蛋白,能与大量mRNA结合,从而调节许多蛋白的合成,这可能是FXS复杂多样临床表现的基础。形态学研究发现FXS患者和Fmr1基因敲除小鼠的树突棘均呈现出瘦长、扭曲的幼稚形态,不成熟的树突棘形成突触的能力严重受损。 最近有蛋白组化研究发现,生长相关蛋白(growth-associated protein 43,Gap43)在Fmr1基因敲除小鼠的海马组织中表达上调。Gap43是80年代初发现的位于脊椎动物神经元胞浆的一种特异性磷酸蛋白,与神经纤维分化、轴突再生及突触可塑性等密切相关,被认为是神经元形态发育的一个内在决定因子,国际上将它列为研究神经生长发育等神经可塑性的首选分子标志物。Gap43的表达与蛋白激酶B(Akt)、细胞外调节蛋白激酶(Erk)的磷酸化水平密切相关,许多生长因子和多肽诱导的Gap43的表达都是由Akt、Erk激酶介导的。我们推测Akt/Erk/Gap43通路参与了FXS的发病机制。本实验拟通过Westernblot检测Gap43及Akt、Erk的磷酸化水平;应用分子克隆技术构建Fmr1-GFP、Akt-GFP和Erk-GFP质粒,转染到PC12细胞中,提取转染后的细胞蛋白,再通过Westernblot检测Gap43的表达水平。本研究旨在探索Fmrp与Akt/Erk/Gap43通路的相互作用机理,为阐明FXS的发病机制提供新的思路,为寻求新的FXS药物治疗靶点提供理论依据。 材料与方法: 本实验小鼠采用杂合子方式繁殖和饲养,同一母鼠生育的雄鼠约一半是WT鼠(X+Y),作为对照组;约一半是KO鼠(XˉY),作为实验组。FVB品系小鼠在19～21℃自然光的条件下饲养,让它们自由获取食物和水。实验前剪取少许尾巴提取DNA,PCR及Western blot技术鉴定小鼠基因型。随机选取出生后10周的雄性小鼠,用Western blot法检测海马组织中磷酸化Akt308(p-Akt308)、磷酸化Akt473(p-Akt473)、总Akt(T-Akt)、磷酸化Erk(p-Erk)、总Erk(T-Erk)及Gap43等蛋白的表达(WT、KO各取6只);构建Fmr1-GFP、Akt1-GFP、Erk1-GFP质粒,在PC12细胞中过表达其中一种或两种蛋白后研究Gap43的表达变化。 结果: 1.10周龄KO与WT小鼠海马组织Akt、Erk、Gap43蛋白的表达 Western blot结果显示10周龄KO小鼠海马组织中p-Akt308、p-Akt473、p-Erk、Gap43的表达均比同龄WT小鼠增加,差异有统计学意义;而T-Akt、T-Erk在KO小鼠海马的表达与WT小鼠相比差异无统计学意义。 2.PC12细胞转染相关质粒后Gap43蛋白的表达 PC12细胞采用脂质体lipo2000转染质粒,过表达Akt或者Erk,显著促进了Gap43的表达,但是同时过表达Fmrp可以削弱这种作用;单独过表达Fmrp对Gap43的表达没有明显影响。 结论: Fmrp对Akt、Erk有负性调节作用,通过降低它们的磷酸化水平实现。Fmr1KO小鼠由于Fmrp的缺失导致了Akt、Erk通路的激活,从而增加了Gap43的表达,表明Akt/Erk/Gap43通路参与了脆性X综合征的发病机制。