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目的:
人类免疫缺陷病毒(human immunodefi后病毒与机体免疫应答相互作用的初始阶段，高水平病毒复制是其重要特征[1]。病毒复制适应性是指病毒因其遗传多样性导致快速进化并在感染宿主过程中改变自身复制能力从而适应宿主环境的能力[2]。对于原发感染者病毒复制适应性研究较少，争议较多。多数研究者认为病毒在突破宿主粘膜屏障的过程中经历遗传瓶颈效应，病毒准群单一且病毒复制适应性低[8]。最新研究从B亚型原发感染者获取的原代分离株病毒具有较高的复制适应性[10]。国外研究显示B亚型及CRF_BC亚型慢性感染者病毒复制适应性与HIV-1感染者疾病进展密切相关，由病毒和宿主因素共同影响病毒复制适应性。提示复制适应性下降可能是延缓疾病进展的重要因素。病毒复制适应性可以作为疾病进程的指标，甚至对于HIV感染者疾病进程的特定阶段，HIV复制能力的变化较病毒载量意义更大。
针对我国MSM人群CRF01 AE原发感染者及慢性感染者病毒复制适应性情况及不同病毒复制适应性对疾病进展的影响尚不明确。原代分离株能有效代表原发感染者病毒适应性情况[11]。而对于我国MSM人群CRF01 AE原发感染者血浆分离株与外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)分离株病毒差异尚不明确。本研究以HIV-1原发感染者(Primary HIV-1 infection，PHI)和慢性感染(Chronic HIV infection，CHI)为研究对象，以HIV-1基因组中env，nef,gag区为研究目标，以TA克隆的方法获取感染原发感染者血浆、血浆原代分离株株及PBMC原代分离株序列，对比原发感染者病毒及其原代分离株病毒特征差异ciency virus，HIV)原发感染指HIV侵入机体。利用原代分离株对不同疾病进展结局的原发感染者及慢性感染者进行体外病毒适应性检测，观察不同疾病进展结局感染者病毒复制适应性变化。
方法:
一、研究对象
原发感染12例，慢性感染者11例。
二、实验方法
（一）病毒核酸提取
以140μl血浆按照QIAamp Viral RNA Mini Kit说明书步骤提取病毒基因组RNA。以1×106个细胞按照QIAamp DNA Blood Mini Kit说明书步骤提取前病毒基因组DNA。
（二）PCR扩增、产物纯化及基因序列测定
使用反转录PCR和套式PCR方法，分别扩增gag基因、env基因及nef基因。PCR产物纯化参照QIAquick Gel Extraction Kit操作步骤。利用测序引物进行测序反应，纯化后上机检测。
（三）PCR反应产物纯化
取终产物5μ1进行1％琼脂糖凝胶电泳，经Ultra-Violet Product凝胶成像后与marker比对，确认所需片段，用QIAquik Gel Extraction Kit试剂盒纯化基因片段。
(四)TA克隆
扩增的基因片段插入克隆载体pMDTM18-T Simple Vector，转入化学感受态菌DH5a扩大培养，然后提取质粒DNA双脱氧终止法测序。
（五）序列分析
采用BioEdit软件对测序结果进行编辑处理，然后进行拼接。用Mega5.0软件自展法(bootstrap)重复运算1000次构建Neighbor-Joining(NJ)进化树。利用Mega软件中的distance程序计算序列间的基因距离。
（六）病毒载量测定
以1ml血浆采用标准版模板制备法提取RNA，使用COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-12.0(ROCHE)以TaqMan RT-PCR方法测定病毒载量。
（七）CD4+T淋巴细胞测定
20μl CD4/CD8/CD3 TriTEST试剂加入TruCOUNT管中，加入50μl抗凝血，室温避光15min，加入免洗溶血素450μl，室温避光15min，用FACS MMLTISET软件检测并进行自动分析、计算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞绝对值及相应比值等。
（八）HIV-1病毒分离
利用密度梯度离心法分离正常人和HIV-1感染者的PBMC;采用PBMC共培养法及血浆共培养法分离病毒。每3-4天换液1次，每7天添加1次经PHA刺激生长3天的正常淋巴细胞。定期对培养细胞上清中的HIV-1p24抗原含量进行检测。
（九）HIV-1复制适应性检测（平行感染实验）
利用平行感染时实验检测病毒复制能力
（十）HIV-1 p24抗原检测
参照美国Zeptometrix公司HIV-1 p24抗原定量检测试剂盒说明书进行检测。
（十一）统计学处理
本研究涉及统计分析和相关性分析均采用spss17.0软件包处理。
结果:
一、HIV原发感染者血浆、血浆分离株及PBMC分离株NJ系统进化树、基因多样性及病毒复制适应性比较
1、HIV原发感染者血浆、血浆分离株及PBMC分离株NJ系统进化树
血浆序列、血浆分离株及PBMC分离株病毒序列具有较高的遗传同质性且散在均匀分布。
2、血浆中基因序列、血浆分离病毒株及细胞病毒分离株基因序列多样性比较
原发感染者V期病毒Env区血浆序列与血浆分离病毒株序列间多样性差异大于血浆序列与细胞病毒分离株间多样性差异。IV期病毒血浆中基因序列、血浆分离病毒株及细胞病毒分离株基因序列多样性差异较小。Nef区血浆中基因序列、血浆分离病毒株及细胞病毒分离株基因序列多样性差异较小。Gag区血浆中基因序列、血浆分离病毒株及细胞病毒分离株基因序列多样性差异较小。HIV感染早期病毒分离培养对于病毒env区多样性有增加趋势，但对nef区及gag多样性改变较小。
3、血浆分离病毒株与PBMC病毒分离株的病毒复制适应性血浆分离病毒株复制适应性与PBMC病毒分离株无显著性差异(P=0.28)。
二、HIV原发感染者第一点及感染后一年至两年病毒复制适应性、病毒载量及CD4+T细胞数量的动态观察与比较HIV原发感染者原代分离株的复制适应性显著高于感染一年以后(P=0.016)。
三、不同疾病进展结局的原发感染者病毒适应性、病毒载量及CD4+T细胞比较
TP与RP原发感染者病毒复制适应性没有显著差异，原发者高病毒复制适应性对感染者疾病进展影响较小(P=0.49)。TP与RP原发感染者早期CD4+T细胞计数差异显著(P=0.007)，表明原发感染者CD4+T基线值细胞数量影响其疾病进展。
四、不同疾病进展结局的慢性感染者病毒复制适应性、病毒载量及CD4+T细胞计数对比
TP与RP慢性感染者毒复制适应性差异显著(P=0.038)，提示慢性感染者病毒复制适应性影响其疾病进展。
结论:
1.感染早期血浆分离原代毒株与PBMC分离原代毒株与血浆中病毒无显著差别。
2.MSM人群CRF-01AE亚型原发感染者IV期病毒毒复适应性高于其感染一年后病毒复制适应性。
3.MSM人群CRF-01AE亚型原发感染者高病毒复制适应性对其疾病进展无显著影响。
4.MSM人群CRF-01AE亚型慢性感染者复制适应性高者疾病进展快。