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研究目的:补体旁路途径活化或调节异常参与多种疾病的发生和发展,本研究旨在通过甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶3(MASP3)基因敲除小鼠模型的建立及抗MASP3单克隆抗体的制备以明确MASP3在补体旁路途径活化中的作用,并初步探讨MASP3能否作为治疗旁路途径功能异常相关疾病的新靶点。研究方法:1.MASP3基因敲除小鼠的制备和表型初步分析:本研究采用CRISPR Cas9技术制备了MASP3基因敲除小鼠(MASP3-/-),将特定的crRNA、tracr RNA和Cas9蛋白注射至小鼠受精卵以敲除小鼠MASP1/3编码基因第12外显子的部分序列。因第12外显子含编码MASP3丝氨酸蛋白酶结构域的DNA序列,故成功敲除后的小鼠体内无正常MASP3蛋白表达。在得到F0代小鼠后我们通过PCR以及DNA测序筛选出MASP3基因敲除小鼠。为验证MASP3基因部分敲除后小鼠体内已无MASP3蛋白表达,我们制备了兔抗鼠MASP3多克隆抗体(pAb)并通过western blot检测了F0代小鼠体内MASP3的表达情况。随后我们通过体外旁路途经活性测定试验和红细胞溶解试验检测了MASP3-/-小鼠血清的旁路途径活化活性,从而判断MASP3基因敲除对补体旁路途经活性的影响。此外,我们尝试以重组鼠MASP3蛋白重构了MASP3-/-小鼠体内旁路途经活性。2.抗鼠MASP3单克隆抗体(mAb)的制备及筛选:本研究选用ExpiCHO细胞体外表达并纯化得到重组人和鼠MASP3蛋白。我们以重组鼠MASP3蛋白为抗原,免疫7周龄的MASP3基因敲除小鼠以制备抗鼠MASP3单克隆抗体。经初次免疫和2次增强免疫后通过ELISA测定小鼠的血清抗体效价,当血清抗体效价足够时取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合以制备杂交瘤细胞。经间接ELISA筛选后,结果总计共得到阳性细胞克隆12株。扩大培养后,我们通过G蛋白亲和层析从杂交瘤细胞培养上清液中纯化得到单克隆抗体,随后我们通过ELISA对纯化后的抗体进行了靶蛋白结合活性的测定并通过体外建立的功能筛选试验筛选出了可拮抗鼠MASP3酶活性的单抗。此外,我们同时检测了所得单抗与重组人MASP3蛋白的交叉结合活性及对人MASP3的功能抑制活性。我们通过构建MASP3基因敲除小鼠和制备抗MASP3单克隆抗体这两条途径分析MASP3在旁路途径活化中的作用,并由此探索能否通过拮抗MASP3阻断补体旁路途径的活化,从而为旁路途径活性异常相关疾病提供新的治疗思路。研究结果:1.本研究中所得到的F0代小鼠中的MASP3基因敲除小鼠补体旁路途经活化活性均较野生型小鼠有不同程度的减低,但并非完全缺失。在经尾静脉注射了Crry-/-C3-/-红细胞后,野生型小鼠因体内旁路途经活性正常,故很快导致了红细胞的溶解,而因MASP3-/-小鼠体内补体旁路途经活性减低,Crry/C3-/-红细胞得以在体内存活更长时间。此外,注射重组鼠MASP3蛋白可重构MASP3基因敲除小鼠的血清补体旁路途经活性。2.本研究所制备的抗鼠MASP3单克隆抗体与重组鼠MASP3具有高结合活性,且与重组人MASP3存在交叉结合活性。经体外功能筛选试验检测,单克隆抗体7C8-26可在体外阻断鼠MASP3和人MASP3的前体D因子活化活性,从而抑制旁路途经的活化,且其对鼠MASP3的拮抗活性更强。研究结论:MASP3通过活化D因子参与补体旁路途经的活化,小鼠体内缺失MASP3表达将导致补体旁路途经活性减低。但MASP3并非D因子唯一活化酶,缺失MASP3的情况下体内仍存在其他可以介导旁路途经活化的因子。在体外,阻断MASP3的酶活性可有效抑制旁路途经活化。