论文部分内容阅读
背景及目的：钠通道在可兴奋细胞动作电位的产生和信号传导中起着重要的作用，其结构与功能的改变与许多疾病的发生和发展密切相关。癫痫为最常见的神经系统疾病之一，其发病机制目前并不十分清楚，但其发作的病理生理学核心是脑内神经元超兴奋性，即受累神经元过度去极化，使足够数量的神经元同步去极化，造成大量钠离子内流，并形成可传播的动作电位，产生癫痫的发作。目前，越来越多的证据表明，钠通道的功能障碍与癫痫的发生发展密切相关，因此钠通道已成为目前抗癫痫药物开发的重要靶点。我室张万琴教授多年从事蝎毒药物开发研究，从蝎毒毒素中提取出具有抗癫痫作用的活性多肽。通过特殊工艺处理后，获得具有抗癫痫作用的蝎毒耐热蛋白。本课题是应用全细胞膜片钳技术在急性分离的大鼠海马神经元上观察蝎毒耐热蛋白(ScorpionVenomHeatResistantProtein，SVHRP)对河豚毒素敏感型(TetrodotoxinSensitive，TTX-S)电压门控性钠通道的影响，以期深入探讨蝎毒耐热蛋白抗癫痫作用可能的分子机制。
材料与方法：应用全细胞膜片钳技术，以急性分离的7-10天Sprague-Dawley(S.D.)大鼠海马神经元为研究对象，观察蝎毒耐热蛋白对海马神经元TTX-S型电压门控性钠通道电生理学特性的影响。用胰蛋白酶消化加机械分离方法分离获得海马神经元，在膜片钳全细胞模式下，对细胞膜上钠离子通道的电生理活动进行记录。电极内液中的CsCl阻断钾通道，细胞外液中的CdCl2阻断钙通道，全细胞模式记录到一内向电流，此内向电流可以被1μM河豚毒素完全阻断，证实此通道为TTX-S钠通道。通过形态学及电生理学方法鉴定海马神经元后，观察蝎毒耐热蛋白对海马神经元电压门控性钠通道电流电生理学特性的影响。
结果：倒置生物显微镜下观察，分离完整的海马神经元表面光洁，有较强的晕光，而且有较长的轴突和树突。胞体成锥形或三角形，有一个轴突，两个或多个树突，轴突可长达200μm以上。完整的海马神经元维持其形态至少4个小时。由EPC-10膜片钳放大器电流钳模式测得细胞膜静息膜电位(RestingPotential，RP)为-56.25±9.32mV(n=62)。膜电容(MembraneCapacitance，Cm)为12.98±0.77pF(n=36)。串联电阻(SeriesResistance，Rs)为15.28±1.13MΩ(n=36)。细胞膜的时间常数τ=Cm×Rs，τ值为209.78±23.74μs。1.四种不同浓度的SVHRP(0.0001～1μg/m1)，均能降低海马神经元TTX-S钠通道电流峰值，为浓度依赖性关系，与对照组相比具有显著差异(P＜0.01)。经过Hill方程拟合，半数抑制浓度IC50为0.0005534μg/ml，Hill常数为n=0.30032。2.四种不同浓度的SVHRP在-50mV～+20mV膜电位内均能使钠电流的幅度降低。3.SVHRP处理过的海马神经元稳态激活曲线发生变化。正常TTX-S型钠电流的半数激活电压(V1/2)为-34.38±0.62mV(n=16)，斜坡因子(κ)为4.52±0.52。给予0.01μg/mlSVHRP后V1/2变为-30.30±0.55mV(n=8，P＞0.05)，无统计学意义，κ为4.41±0.14；给予0.1μg/mlSVHRP后V1/2变为-23.96±0.41mV(n=8，P＜0.05)，有统计学意义，κ为3.73±0.08。结果表明SVHRP可以浓度依赖性使电压门控性钠通道激活曲线向正电位方向移动，即通道开放减慢。4.SVHRP处理过的海马神经元稳态失活曲线亦发生变化。正常TTX-S型钠电流的半数失活电压(V1/2)为-32.60±1.52mV(n=16)，斜坡因子(κ)为6.73±0.51，在给予0.01μg/ml的SVHRP后V1/2变为-44.56±1.79mV(n=8，P＜0.01)，斜坡因子κ变为5.77±0.61；给予0.1μg/ml的SVHRP后V1/2变为-50.69±2.55mV(n8，P＜0.01)，斜坡因子κ变为5.49±0.72；表明激活曲线的V1/2向负电位方向移动，即钠通道的失活加快。
结论：1.蝎毒耐热蛋白可以降低电压门控性钠通道电流的幅值。2.蝎毒耐热蛋白可以减慢电压门控性钠通道的开放过程。3.蝎毒耐热蛋白可以加快电压门控性钠通道的失活。4.蝎毒耐热蛋白有可能通过影响海马神经元钠通道的电生理学特性从而达到抗癫痫的作用。