研究背景和目的在近30多年里,人类辅助生殖技术(assisted reproductive technology, ART)得到了迅猛发展。但目前IVF周期的胚胎着床率大约在20%左右,妊娠率在30%～40%,活胎出生率在25%左右,主要原因之一在于超促排卵周期所获卵子成熟度不同,发育潜能不一,且有相当一部分发育异常,不能受精或不能形成高质量的胚胎。如何获得更优质的成熟且发育潜能良好的卵子,是目前辅助生殖技术的迫切需要。另一方面,目前ART实验室对卵子及胚胎的选择,主要依靠形态学标准,而形态学标准尚不统一,具有对卵子发育潜能评估不准确的缺点,且评价较为主观、依赖于工作人员的技术和经验,现尚缺乏更有效的无创性检测方法来判断卵母细胞发育潜能。由于取卵时可获得数目较多的卵丘细胞,在卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)前卵丘细胞甚至被丢弃,如果能在卵丘细胞中找到合适的卵母细胞成熟标志,将有利于ART成功率的提高。对于如何筛选更优质的成熟卵母细胞用于ART,卵丘细胞是一种合适的备选细胞。在卵丘细胞中找到有意义的生物学标记物,并进一步研究其作用途径和机制,有助于揭示卵泡发育和成熟的机制,也可能为促排卵方案的进一步完善,及实验室体外培养体系的改进提供新的思路。卵丘细胞是在卵泡发育后期,由颗粒细胞分化而来的一种特殊的细胞亚群,它包裹在卵母细胞周围,与卵母细胞通过广泛而复杂的细胞间连接机制形成卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,COCs),起着调节卵母细胞发育的重要作用。卵丘细胞一方面运输营养物质给卵母细胞,同时也是激素、生长因子等多种物质对卵母细胞发挥作用的介质,另外卵丘细胞可以贮存和释放某些生长因子和某些特定蛋白质,这些物质在卵母细胞成熟及胚胎发育过程中按一定顺序表达或选择性地弥散来发挥作用。在卵丘和卵母细胞之间,存在着复杂精细的调控与对话,尽管在此方面已进行了大量的研究,但尚有许多细节未能阐明。蛋白质是各种生物学过程的最终执行者。蛋白质组学是一种全面分析蛋白质表达变化的有力研究工具,差异蛋白质组学则通过比较样本间蛋白质表达水平的变化,寻找差异分子,用以解决各种各样的生物学问题。在各种蛋白质组学分析方法中,近年来的荧光差异凝胶电泳(two-dimensional difference gel electrophoresis,2D-DIGE)技术的出现是一个重要进展。而相比普通的硝酸银染色,考马斯亮蓝染色等方法,2D-DIGE更加具有其优越性,它是唯一应用内标(internal standard)的蛋白质组学方法,继承了二维凝胶电泳的高分辨率,同时又具备高重现性、高灵敏度、高通量和高动态范围等优势,使其日益受到关注,成为最受欢迎的差异蛋白质组学研究手段之一。目前关于卵巢生殖细胞及体细胞的蛋白质组学研究尚处于起步阶段,尚未见关于卵丘细胞与卵母细胞成熟度相关的蛋白质组学研究,本课题选取生育年龄妇女超促排卵周期获得的卵丘细胞,利用2D-DIGE技术、基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(matrix-assist laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)及有关生物信息学方法,研究在卵泡发育晚期,不同成熟阶段的卵母细胞周围的卵丘细胞的差异蛋白质表达,尝试寻找卵丘细胞中与卵母细胞成熟相关的关键蛋白质,并对其生物学功能进行初步探讨,为阐明卵丘细胞与卵母细胞成熟的关系提供分子水平的依据,并为临床辅助生殖技术中的超促排卵方案的改进,体外培养体系的完善、寻找评估卵母细胞发育潜能的客观指标提供理论基础。第一章不同成熟程度人卵母细胞周围的卵丘细胞的差异蛋白组学研究目的：利用2D-DIGE技术,建立不同成熟阶段卵母细胞周围的卵丘细胞荧光差异蛋白组图谱；利用MELDI-TOF-MS技术鉴定差异蛋白,并对差异蛋白进行生物信息学分析,初步筛选卵丘细胞中的卵母细胞成熟相关蛋白。研究方法：1.标本来源及分组：人卵丘细胞取自2009年6月至2009年12月因单纯男方因素不孕在南方医院生殖中心行ICSI治疗的妇女,共89例。均采用黄体中期长方案降调节。取卵后按卵母细胞成熟度将对应的卵丘细胞分为两组：MII期卵母细胞周围的卵丘细胞为成熟组,GV期卵母细胞和MI期卵母细胞周围的卵丘细胞为未成熟组。2.2D-DIGE分析提取卵丘细胞总蛋白,经蛋白质纯化和定量后,进行2D-DIGE分离。2D-DIGE分析胶中预先被Cydye染料标记的蛋白质斑点,经多功能激光扫描仪不同波长的激光扫描后,获取荧光胶内差异蛋白表达图谱,使用DeCyder软件分析,得到差异表达的蛋白质斑点。制备胶采用考马斯亮蓝蛋白染色并扫描。3.差异蛋白的质谱鉴定：将与分析胶匹配的制备胶装入全自动斑点处理工作站并固定,选取两组蛋白表达差异1.5倍以上的蛋白质斑点,完成差异蛋白斑点的切取、脱色、酶切和质谱靶点样。利用MALDI-TOF-MS进行蛋白质质谱鉴定,并到本地NCBI、在线MASCOT蛋白质数据库验证,将凝胶图谱和质谱数据综合,筛选出差异蛋白质,构成不同成熟程度卵母细胞相关的人卵丘细胞差异蛋白质谱。4.差异蛋白的生物信息学分析登陆有关生物信息学网站：http://www.expasy.ch/sprot/、http://www.geneontology.org/、http://gather.genome.duke.edu/,查询差异蛋白的亚细胞定位、生物学过程、分子功能及蛋白聚类,在PubMed查阅相关文献,分析差异蛋白表达的意义。结果：1.建立成熟与未成熟卵母细胞周围的卵丘细胞双向凝胶差异蛋白图谱,并利用DeCyder软件及分析,获得表达差异1.5倍以上的蛋白质斑点25个。2.经质谱和数据库分析,共鉴定出18种差异蛋白质,其中在成熟组卵丘蛋白表达上调的蛋白质有8种,下调的蛋白质有10种。3.经生物信息学分析,按照参与的生物学过程和分子功能,18种差异蛋白质可分为五类：参与能量和物质代谢的酶类、参与物质转运和平衡类蛋白、参与遗传信息存储和处理类蛋白、参与细胞骨架和细胞分裂类蛋白及未分类蛋白。小结：1.建立了人卵丘细胞双向差异凝胶电泳的可靠的技术平台,成功获得了成熟与未成熟卵母细胞周围的卵丘细胞2D-DIGE蛋白图谱。2.利用MELDI-TOF-MS技术鉴定出成熟与未成熟卵母细胞周围的卵丘细胞中差异蛋白质共18种,其中在成熟组卵丘蛋白表达上调的蛋白质有8种,下调的蛋白质有10种。3.通过生物信息学分析,18种差异蛋白归类为五类：参与能量和物质代谢的酶类、参与物质转运和平衡类蛋白、参与遗传信息存储和处理类蛋白、参与细胞骨架和细胞分裂类蛋白及未分类蛋白等五类,它们可能与卵母细胞成熟过程中卵丘细胞活跃的能量代谢、物质转运、细胞粘附及运动、增殖分裂等重要的生物学过程有关。第二章Annexin A5在卵丘细胞的表达及意义探讨目的：对采用蛋白质组学技术鉴定出的差异表达蛋白可能具有重要的生物学意义,为保证其可信性及进一步研究的确定性,有必要对它们的表达进行验证,这也是对其进行功能分析的基础。膜联蛋白A5 (Annexin A5)是我们鉴定出的可信度为100%的蛋白之一,与未成熟组相比,Annexin A5在成熟组卵丘细胞中的表达增强1.58倍。本章中,采用免疫印迹(Western Blot)和细胞免疫化学方法,对在不同成熟程度卵母细胞周围的卵丘细胞中Annexin A5的表达进行定位和半定量分析,并探讨其与卵母细胞成熟的关系。研究方法：1.标本来源及分组：人卵丘细胞取自2010年2月至2010年5月南方医院生殖中心行ICSI治疗的妇女,共62例。纳入标准同第一章。卵丘细胞收集和分组同第一章。2. Western Blot检测两组细胞Annexin A5蛋白的表达水平差异,结果以凝胶图像分析系统分析目的条带的灰度值判断。3.免疫细胞化学方法检测Annexin A5在卵丘细胞表达的定位及表达水平差异,结果以染色阳性细胞数和染色特征计分值来判断。4.采用SPSS13.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,两组间比较采用两独立样本t检验；计数资料两组间比较采用Mann-Whitney检验,P<0.05视为有统计学意义。结果：1. Western Blot检测两组细胞Annexin A5蛋白的表达：经两独立样本t检验,成熟组卵丘细胞中,Annexin A5表达水平显著高于未成熟组(t=4.64,P=0.010),与2D-DIGE结果一致。2.免疫细胞化学检测两组细胞Annexin A5蛋白的表达：两组卵丘细胞均有Annexin A5表达,定位于卵丘细胞的胞质和胞膜,经Mann-Whitney检验,成熟组卵丘细胞Annexin A5的表达强度显著高于未成熟组(Z=2.138,P=0.033),说明在卵泡发育的后期,随着卵母细胞的成熟,卵丘细胞中Annexin A5的表达上调。小结：采用Western Blot和细胞免疫化学方法,验证了卵丘细胞中Annexin A5的表达,随着卵母细胞的成熟,卵丘细胞中Annexin A5的表达上调。推测Annexin A5蛋白表达水平的变化可能与体内LH峰的作用有关,并可能与LH峰伴随的卵丘膨胀、卵丘细胞的活跃增殖与代谢、与细胞外基质的黏附、卵丘细胞内钙离子浓度波动等生物过程有关。卵丘细胞表达的Annexin A5可能是一种潜在的卵母细胞成熟相关蛋白。第三章CRBP-1在卵丘细胞的表达及意义探讨目的：细胞视黄醇结合蛋白-1(Cellular retinol-binding protein 1,CRBP-1)是我们鉴定出的另一种可信度为100%的蛋白,与未成熟组相比,CRBP-1在成熟组卵丘细胞中的表达降低1.73倍。CRBP-1是负责细胞内转运视黄醇的蛋白,在细胞对视黄醇的摄取、转运、代谢中起重要作用；视黄醇结合蛋白-4(Retinol-binding protein-4,RBP-4)则是负责血浆中视黄醇的转运的蛋白质,既往研究报道在卵泡液中发现RBP-4。我们采用免疫印迹(Western Blot)和细胞免疫化学方法,检测在不同成熟程度卵母细胞周围的卵丘细胞中CRBP-1的表达,并应用酶联免疫法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELASA)方法检测对应卵泡液中RBP-4的水平,以期探讨CRBP-1及视黄醇类在人卵泡发育和卵母细胞成熟中的作用。研究方法：1.标本来源及分组：人卵丘细胞来源和分组同第二章。人卵泡液来源于同期因单纯男方因素不孕行ICSI治疗的妇女58例。成熟组：取卵时首先穿刺直径大于16mm的卵泡,同时镜下观察证实获取的卵泡液中为MII期卵母细胞,共30份；未成熟组：取卵时首先穿刺直径小于10mm的卵泡,同时镜下观察证实获取的卵泡液中为GV期卵母细胞或MI期卵母细胞,共28份。2. Western Blot检测两组卵丘细胞CRBP-1蛋白的表达水平差异,结果以凝胶图像分析系统分析目的条带的灰度值判断。3.免疫细胞化学方法检测CRBP-1在卵丘细胞表达的定位及表达水平差异,结果以染色阳性细胞数和染色特征计分值来判断。4. ELASA法检测两组卵泡液中RBP-4的水平。5.采用SPSS13.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,两组间比较采用两独立样本t检验；计数资料两组间比较采用Mann-Whitney检验,P<0.05视为有统计学意义。结果：1. Western Blot检测两组卵丘细胞CRBP-1蛋白的表达：经独立样本t检验,成熟组卵丘细胞中,CRBP-1表达水平显著低于未成熟组(t=-10.760,P<0.001),与2D-DIGE结果一致。2.免疫细胞化学检测两组卵丘细胞CRBP-1蛋白的表达：两组卵丘细胞均有CRBP-1表达,定位于卵丘细胞的胞浆。经Mann-Whitney Test,成熟组卵丘细胞CRBP-1的表达强度显著高于未成熟组(Z=1.977,P=0.048),说明在卵泡发育的后期,随着卵母细胞的成熟,卵丘细胞中CRBP-1的表达下调。3. ELASA检测成熟组卵泡液RBP-4浓度为49.90±7.19μg/ml,未成熟组卵泡液RBP-4浓度为38.48±9.46μg/ml,成熟卵泡液中RBP-4浓度增加,两组比较差异有统计学意义(t=5.194,P<0.001)。小结：1.采用Western Blot和细胞免疫化学方法,验证了卵丘细胞中CRBP-1的表达,随着卵母细胞的成熟,卵丘细胞中CRBP-1的表达下调。2. CRBP-1和RBP-4分别为细胞内和细胞外结合和转运视黄醇的蛋白,随着卵泡发育和卵母细胞的成熟,卵丘细胞表达CRBP-1下降,卵泡液中RBP-4上升,提示卵丘细胞利用视黄醇减少,胞内视黄醇转运至卵泡液而被利用,并最终作用于卵母细胞,有利于卵母细胞的成熟。推测卵丘细胞表达的CRBP-1可能是一种潜在的卵母细胞成熟相关蛋白。全文小结1.建立成熟与未成熟卵母细胞周围的人卵丘细胞双向凝胶差异蛋白图谱,鉴定出18种差异表达的蛋白,其中在成熟组卵丘蛋白表达上调的蛋白质有8种,下调的蛋白质有10种。2.经生物信息学分析,按照参与的生物学过程和分子功能,18种差异蛋白质可分为6类：参与能量和物质代谢的酶类、参与物质转运和平衡类蛋白、参与遗传信息存储和处理类蛋白、参与细胞骨架和细胞分裂类蛋白及未分类蛋白,它们可能与卵母细胞成熟过程中卵丘细胞活跃的能量代谢、物质转运、细胞粘附及运动、增殖分裂等重要的生物学过程有关。3.经Western Blot和细胞免疫化学方法验证,发现人卵丘细胞中Annexin A5的表达水平随卵母细胞的成熟而上调。推测Annexin A5蛋白表达水平的变化可能与体内LH峰的作用有关,并可能与LH峰伴随的卵丘膨胀、卵丘细胞的活跃增殖与代谢、与细胞外基质的黏附、卵丘细胞内钙离子浓度波动等生物过程有关。卵丘细胞表达的Annexin A5可能是一种卵母细胞成熟相关蛋白。4经Western Blot和细胞免疫化学方法验证,发现人卵丘细胞中CRBP-1的表达水平随卵母细胞的成熟而下调。随着卵泡发育和卵母细胞的成熟,卵丘细胞表达CRBP-1下降,卵泡液中RBP-4上升,提示卵丘细胞利用视黄醇减少,胞内视黄醇转运至卵泡液而被利用,并最终作用于卵母细胞,可能有利于卵母细胞的成熟及之后的胚胎发育。卵丘细胞表达的CRBP-1可能是一种卵母细胞成熟相关蛋白。