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人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)属于疱疹病毒科β亚科,人群感染率高(HCMV抗体阳性率约50~90%),原发感染后即建立潜伏感染,终身携带病毒。HCMV感染在免疫力健全人群体内常处于潜伏状态,不产生疾病和无临床症状,但对于免疫功能尚未成熟的胎儿、免疫系统受损的AIDS病人、免疫力被人为抑制的器官移植病人,HCMV感染常威胁健康甚至危及生命。潜伏感染是巨细胞病毒的重要特性,但由于HCMV感染具有严格的种属特异性(即只感染人和人源组织/细胞),所以建立合适的人源细胞感染模型并深入研究其特性,将为阐明HCMV潜伏感染机制提供条件。 本实验室前期研究了神经类细胞系SY5Y、CCF、A172、T98G对HCMV感染的容许性,发现其中的胶质母细胞瘤细胞T98G是一种具有半容许性特征的细胞系,可作为HCMV潜伏感染模型的候选细胞。本研究主要目的是:在前期研究基础上,对T98G展开更全面的感染特性研究,并与目前公认的潜伏感染THP-1细胞模型进行比较;为进一步研究潜伏感染机制、HCMV与胶质母细胞瘤形成关系、HCMV(先天性)感染诊断与治疗等奠定基础。 免疫荧光(Immunofluorescence assay,IFA)是研究HCMV及其它病毒的重要方法之一。本研究首先建立了追踪HCMV感染过程与感染进度的经济快速的免疫荧光方法(f-IFA)。与传统方法相比,在保证染色质量的同时缩短染色时间(45 min)与节省抗体使用量(抗体用量可低至传统方法的1/60)。并应用该方法来监测HCMV感染中病毒基因表达。 本论文应用快速免疫荧光法、聚合酶链式反应、荧光原位杂交、蛋白质印迹等技术比较分析了HCMV感染的混合T98G细胞、经FACS纯化的抗原阳性(IE2+T98G)和抗原阴性(IE2-T98G)细胞群、HCMV感染的THP-1/d-THP-1细胞IE基因表达及病毒DNA水平,并通过检测病毒受体表达谱及T98G细胞培养上清中分泌性分子对病毒复制的作用,对HCMV在T98G细胞内的潜伏机制进行初步研究。结果发现:(1)T98G是一种方便培养且成本低的实验细胞系;(2)与公认的HCMV潜伏感染的单核细胞系THP-1相比,胞内的HCMV拷贝数更高,高拷贝数的HCMV基因组持续存在于细胞中,持续存留时间更长(至少持续至40 d);(3)T98G属于神经类细胞,不仅可用于HCMV潜伏感染机制研究还可用于研究HCMV感染与胶质瘤疾病的关系。对HCMV感染T98G后潜伏机制的初步研究表明,HCMV感染T98G后其主要立即早期启动子(MIEP)活性被抑制及进入潜伏周期的决定性因素在于细胞内在的分子机制,而与细胞表面的病毒受体谱及细胞分泌的因子无明显相关。因此,T98G可以作为HCMV潜伏感染神经细胞模型。