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大豆疫霉可引起大豆根和茎秆的腐烂,给大豆种植带来巨大的风险。大豆疫病的防治主要通过合理布局种植大豆抗病品种、喷施有效的杀菌剂和改进田间管理措施来实现,但随着杀菌剂的不当施用大豆疫霉对杀菌剂产生了抗性,部分药剂防治效果显著下降。在我国大力推进绿色农业,改进农业生产方式,实现化肥农药使用负增长的背景下,以生物防治技术实现大豆疫病的防治具有重要意义。本文筛选了生物防治细菌,并研究它们对大豆疫病的防治效果及相关作用机理。我们以转录组与代谢组联用技术从基因表达和代谢物变化两个层面展开研究。通过生物信息学分析挖掘候选基因,以基因敲除和沉默技术验证候选基因的功能,本研究将为有效的开发大豆疫病生物防治靶向药剂提供理论依据。主要研究结果如下:1.从健康大豆土壤中分离到1株对大豆疫病具有良好防治效果的菌株JDF3,该菌株可以抑制大豆疫霉菌丝的生长、游动孢子的游动和休止孢的萌发。菌落JDF3在LB培养基上为浅黄色,圆形、不凸起、边缘不光滑。菌株JDF3为杆状、革兰氏阳性、可形成芽孢,经生理生化试验初步鉴定为芽孢杆菌属,以通用引物（27F和1492R）和gyrB基因特异性引物扩增测序,在NCBI数据库中比对分析鉴定该菌株为淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。另外,本实验室保存的枯草芽孢杆菌RSS-1（Bacillus subtilis RSS-1）对大豆疫霉也具有良好的抑制效果,与B.amyloliquefaciensJDF3相似,它主要是通过抑制大豆疫霉菌丝的生长、游动孢子的游动和休止孢的萌发,来实现对大豆疫霉的抑制。它们的发酵液均能较好的抑制大豆疫霉侵染大豆。2.枯草芽孢杆菌RSS-1和解淀粉芽孢杆菌JDF3对大豆疫病具有良好的防治效果,防治效果在65.5-70.7%范围内。它们的防治机制主要包括两个方面即抑制大豆疫霉菌的生长和提高植物的抗病性,其中活性氧进发、肼胝质积累、木质素的增加、气孔的关闭运动和大豆抗性基因的上调表均和芽孢杆菌防治大豆疫病的机制紧密相关。解淀粉芽孢杆菌JDF3发酵液可引起本氏烟叶片产生HR反应,可诱导活性氧进发、气孔的关闭运动和NO的产生。芽孢杆菌RSS-1和JDF3可诱导大豆黄化苗胼胝质不同程度的积累和大豆的木质素化。此外,越来越多的证据表明植物叶和根与微生物协同作用在种植过程中在提高植物抗病性、抗逆性,促进植物生长和产量等方面均具有良好的积极作用。灌根枯草芽孢杆菌RSS-1和解淀粉芽孢杆菌JDF3可不同程度的促进大豆根系发育和植株鲜重增加。3.以比较转录组学与代谢组学联用技术来分析两株芽孢杆菌抑制大豆疫霉的分子机制。结果显示在芽孢杆菌胁迫处理作用下,大豆疫霉共有1616个差异表达基因（DEGs）被检测到,这些DEGs经维恩图分析发现主要参与了两种型的调控,即“特异性”调控和“共同性”调控。参与共性调控的DEGs主要涉及核糖体的功能,且几乎全部下调,它们可能主要通过抑制核糖体的生物学功能来抑制大豆疫霉的生长。B.subtilis RSS-1处理的大豆疫霉样品“特异性”调控DEGs富集在脂肪代谢和能量代谢通路,而B.amyloliquefaciens JDF3处理的样品“特异性”调控DEGs富集在过氧化物酶体、核黄素代谢、叶酸合成和自噬通路中。代谢组结果显示受抑制的大豆疫霉大多数代谢物质较对照组有明显的差异,氨基酸、脂肪酸和碳代谢途径受到抑制或被干扰,这与转录组结果一致。即核糖体合成蛋白功能,以及与tRNA结合能力受到抑制,导致氨基酸代谢出现异常。而脂肪代谢通路基因下调表达可能致使大豆疫霉棕榈酸和硬脂酸含量下降,在气相色谱与质谱联用检测结果中得到证实。脂肪酸作为真菌细胞膜的主要成分,脂肪酸含量下降会导致细胞膜部分功能受损,并致使大豆疫霉生长受到抑制。通过转录组和代谢组联合分析挖掘了 TOS1-like基因家族,Dicer-like小RNA编辑相似基因以及ricin-B lectin protein-like基因。它们可能参与了芽孢杆菌抑制大豆疫霉生长的过程,同时这些基因家族可能还与大豆疫霉的致病力相关,值得关注。4.我们对TOSl-like基因家族进行生物信息学分析,发现该基因家族具DUF2401、glycosyl hydrolase（GH）和glycine-rich protein等保守功能域,这些基因序列与TOS1家族序列和保守功能与相似,暂定为TOSl-like基因家族。将该家族中具有glycine-rich protein和glycosyl hydrolase保守功能域的一个假定蛋白基PHYSODRAFT555423命名为PsGRGH。生物信息学预测基因PsGRGH表达的蛋白可能定位与细胞膜上,参与大豆疫霉生长和致病力调控。我们利用CRISPR-Cas9技术敲除该基因致使大豆疫霉生长速率和致病力不同程度的下降,且对两株芽孢杆菌的胁迫更加敏感。另外,在本氏烟上瞬时表达该基因,证实该基因定位于细胞膜上,它具有激发子活性可在拟南芥和番茄叶片上引起过敏性坏死反应（HR）,提高它们对核盘菌的抗病性。此外,原核表达蛋白PsGRGH与已报道的极细链格孢蛋白PeaT1和大豆疫霉效应分子CRN115类似,也可以提高植物的抗旱能力。5.我们利用转录组和代谢组联用技术,挖掘了 2个候选基因PHYSODR4FT478479（ricin-B lectin protein-like基因,暂时命名为PsRBLGH1）和PHYSODRAFT489360（Dicer-like基因,暂时命名为PsDCL 489360）。以基因沉默和敲除技术,分别沉默和敲除了这两个基因并获得转化子,然后以这些转化子为实验材料,来研究两个基因的功能。结果显示,基因PsRBLGH1参与了大豆疫霉的生长和侵染大豆的过程,沉默该基因后,大豆疫霉菌丝的生长速度减慢,其致病力也显著降低,但是该基因对大豆疫霉菌丝形态和孢子囊的产生没有明显影响。基因PsDCL—489360对孢子囊的产生同样没有显著性作用,但它的敲除致使大豆疫霉菌丝分岔和扭曲,而敲除该基因得到的转化子KOTs,对枯草芽孢杆菌RSS-1和解淀粉芽孢杆菌JDF3发酵液的胁迫作用较WT和CK更加敏感。这表明基因PsDCL 489360可能参与了大豆疫霉对芽孢杆菌的生防胁迫的调控过程。我们推测,该调控过程可能与该基因编辑小RNA有关,有待进一步研究证实。6.植物病原菌群体遗传结构较好的反映了病原菌的进化过程和潜力,深入理解病原群体遗传知识对于病害的防治和防控具有积极的作用,特别是多样性较为丰富的大豆疫霉。以ISSR-PCR技术分析安徽省大豆主要种植地区大豆疫霉的遗传结构。筛选出13对ISSR引物,并对62株大豆疫霉进行ISSR-PCR扩增,发现多态性条带占80.6%,即安徽省大豆疫霉遗传多样性丰富。菌株间的遗传相似系数为0.72～0.96,平均值为0.85遗传变异较高。NJ聚类将它们分为5个聚类组,Mantel’s检验显示（r=0.3938）遗传距离和遗传分化系数与空间距离不相关。不同地理来源间的基因流在0.623～2.773范围内,均值为1.325,表明基因交流非常频繁。在我省含病原菌大豆秸秆还田和未清理的农机设备租赁使用等不当农耕操作可能是基因交流频繁的主要原因。因此,加强大豆作物及种子的检疫,切断长距离的传播渠道,是我省防治大豆疫病,并阻止其扩散传播的必要措施。安徽省大豆疫霉遗传多样性研究对我省大豆疫病有效防控具有一定的指导作用。