论文部分内容阅读
牛疱疹病毒1型(Bovine herpesvirus type 1,BoHV-1)是一种双链DNA病毒,其包括 3 种亚型,分别是 BoHV-1.1、BoHV-1.2a 和 BoHV-1.2b。BoHV-1.1(即本文中的 BoHV-1)可原发性感染造成传染性牛鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)。BoHV-1生产性感染时,部分细胞核内的病毒DNA存在于核小体,BoHV-1中病毒蛋白VP22被证实与组蛋白H4(Histone 4)乙酰化修饰降低有关,除H4外,H3(Histone 3)作为核小体中的另一个序列非常保守的组蛋白,其在病毒感染过程中是否存在作用也值得深入探究。本研究发现病毒感染后显著降低了组蛋白H3以及H3K9ac和H3K18ac为代表的乙酰化组蛋白,同时包括CBP/P300、GCN5L2和PCAF的组蛋白乙酰转移酶家族(HATs)也明显减少。HAT激活剂CTPB提高了病毒复制,反之,HAT抑制剂AA则抑制了病毒复制,恢复了病毒导致的H3K9ac表达降低,表明了 BoHV-1为有效的复制而利用组蛋白的乙酰化作用。此外,HAT抑制剂AA降低病毒立早基因(IE)和病毒衣壳蛋白VP16的表达水平。概括来说,MDBK细胞中HAT依赖性组蛋白乙酰化在病毒复制中起到了重要作用。胞内蛋白有三种降解途径:1、泛素化-蛋白酶体降解途径;2、溶酶体途径;3、自噬作用。为探究病毒是否通过介导上述途径降解乙酰化H3和HATs,于是对此进行更深层次的探索并发现:经IP实验鉴定,病毒感染后H3K9ac未泛素化,而HATs之一的GCN5L2被泛素标记,结合泛素化-蛋白酶体抑制剂MG132抑制病毒复制并恢复病毒引发的乙酰化H3表达降低,推测病毒通过泛素化-蛋白酶体途径部分地介导病毒感染造成的GCN5L2降解,从而降低细胞内组蛋白及其乙酰化;溶酶体抑制剂NH4Cl无此作用;在自噬作用方面,本研究发现病毒感染前期自噬相关蛋白水平无显著变化,而在后期,以自噬标志蛋白LC3-Ⅱ为首的一系列细胞内自噬相关蛋白含量(ATG5、LC3-I、Beclin-1)显著降低,并且血清的添加对此作用无影响。前期自噬抑制剂3-MA对于病毒复制无影响,而后期自噬抑制剂BAF可以拯救病毒感染所致的自噬相关蛋白的损耗,并抑制病毒复制。这一系列结果揭示病毒感染初期需要一定基础水平上的自噬,推测病毒感染后期可能通过抑制自噬以维持自身生存。HATs抑制剂AA可以拯救由病毒感染引发的自噬相关蛋白的降低,而HDACs抑制剂TSA则无作用,意味着HATs在病毒降低自噬相关蛋白中有一定作用,这进一步证实了 HATs和病毒复制之间的关系,侧面印证了 HAT依赖性组蛋白乙酰化在病毒复制中的重要性。本文以BoHV-1感染MDBK细胞时降低胞内H3及其乙酰化为基础,从酶解作用和细胞内三种降解途径这四种方向展开研究,初步构建了 BoHV-1在感染MDBK细胞时对H3及其乙酰化的工作机制。