背景与目的：肾母细胞瘤是儿童最常见的恶性肿瘤之一，全世界15岁以下儿童的发病率约为1/10,000。德国医师Wilms于1899年首次报告此病，因此多数作者称之为Wilms瘤。肾母细胞瘤是小儿最常见的由肾胚基发生的恶性肿瘤，2岁以下发病率最高。儿童恶性肿瘤的死亡率由20世纪80年代的8％上升到了10.7％，小儿肾母细胞瘤已经成为小儿病死的主要原因之一。肾母细胞瘤的临床病理分期和治疗方法的选择与患儿预后有直接的关系，NWTS在其2001年的总结中提到：在目前的影像学技术条件下(依靠CT等)仍有7.0％的漏诊率，主要是直径小于3cm的肾母细胞瘤。而表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization time of flight Mass Spectrometry,SELDI-TOF-MS)是近年发展起来的一种新的蛋白质研究技术，具有快速、简便、高通量及对多样本平行检验的优点，质谱技术及生物信息学方法的出现提供了有效筛选特异性标记物的方法。Ciphergen公司研发的SELDI-TOF-MS技术是一项全新的蛋白质组学研究方法，该技术通过应用少量天然蛋白质提取物来进行快速分析，克服了传统分析方法的局限性。具有样品用量小、操作简便、灵敏度高、高通量等优点，已成功将其应用于卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、直肠癌等恶性肿瘤的诊断、肿瘤标志物的筛选及其他蛋白质组学研究中。本组应用该技术在肝癌，甲状腺癌及肾母细胞瘤前期研究中获得满意效果。应用SELDI-TOF-MS技术结合生物信息学和支持向量机(support vector machine，SVM)方法，筛选出肾母细胞瘤患儿特异性蛋白质标记物，建立肾母细胞瘤临床分期血清蛋白质指纹图谱模型并与CT分期进行对照分析。材料与方法：(1)血清标本共80例均来自郑州大学第一附属医院小儿外科，其中术前肾母细胞瘤30例，其它小儿腹恶性实体肿瘤30例(神经母细胞瘤16例，肝母细胞瘤4例，肾横纹肌肉瘤4例，恶性畸胎瘤4例，胰母细胞瘤2例)，正常对照组20例均来自体检的健康小儿。所有的恶性肿瘤均经免疫组化和2名以上病理学教授证实。术前肾母细胞瘤中男21例，女9例，平均年龄2.10±0.10岁；小儿其它腹部恶性实体肿瘤中男18例，女12例，平均年龄2.50±0.16岁。正常对照组与肾母细胞瘤组年龄性别相配对。所有外周静脉全血标本均于术日前清晨空腹抽取，4℃静置1h后3000 rpm离心10min，分离出的血清储存于-80℃低温冰箱中。CT投照方法：西门子SCT机，扫描范围自膈肌上方1cm至肾下极，间隔8mm，层厚8mm．感兴趣间隔5mm，层厚5mm，扫描时间2s。造影剂采用欧乃派克，剂量1.5-2.0ml/kg。(2)样本冰融，4℃10000 rpm离心2min；取96孔板，放冰盒上，每孔加U9(9M Urea，2％CHAPS，1％DTT)10μl，血清5μl，4℃层析柜600 rpm振荡30 min；振荡结束前15 min做芯片预处理，芯片装入Bioprocessor中并记下芯片号；每孔加NaAC(100 Mm，pH4)200μl，层析柜中600 rpm，5 min，重复1次；U9处理后96孔板放冰上，快速加入NaAC185μl在层析柜中6000 rpm振荡2 min；加已处理好的样本100μl到芯片，层析柜4℃600 rpm振荡1h，甩干，重复3次；用hplc水200μl洗2次快速甩干；用50％饱和的SPA 1μl重复2次；上机检测；将芯片放入Ciphergen读谱仪中检测。(3)用protein chip software 3.1做校正，使总离子的强度及分子量均一化。应用ZUCI-Protein Chip Data Analyze System软件包进行分析。原始数据用离散小波(undecimated discrete wavelet transform)分析去除噪音，并减掉基线。聚类分析以10％为最小阈值，将各个样本中m/z的差异小于0.3％的峰聚为一类。支持向量机(support vector machine，SVM)特征向量的选取采用统计过滤结合模型依赖性筛选的方法建立判别模型，用留一法交叉验证作为评估模型判别效果。(4)．统计学分析所有的蛋白质谱原始数据经过过滤掉信躁和聚类分析处理后，对所有初步筛选出的质荷比峰做Wilconxon秩和检验，选出p值最小的10个峰进一步分析。将10个峰的任意组合(共175种组合)用于支持向量机模型的输入，用留一法评估模型的预测效果，检验标准设α=0.01结果1．肾母细胞瘤Ⅰ肾母细胞瘤和肾母细胞瘤Ⅱ期组肾母细胞瘤Ⅰ期组和肾母细胞瘤Ⅱ期的质谱经过初步过滤筛选得到483个M/Z峰，对其相对强度做Wilconxon秩和检验分析得到P值小于0.01的M/Z峰5个，从差异显著蛋白质峰的任意组合中，采用SVM筛选出预测值的约登(youden)指数最高的组合模型，筛选出M/Z位于7965.4、5022.4和8469.6的标志物3个，在肾母细胞瘤Ⅱ期低表达，在肾母细胞瘤Ⅰ期高表达。联合两个潜在标记物作为输入值，用留一法交叉检验，在测试集上判别模型的敏感性为100％，特异性为100％。2．肾母细胞瘤Ⅰ肾母细胞瘤和肾母细胞瘤Ⅲ期组肾母细胞瘤Ⅰ组和肾母细胞瘤Ⅲ期的质谱经过初步过滤筛选得到496个M/Z峰，对其相对强度做Wilconxon秩和检验分析得到P值小于0.01的M/Z峰4个，从差异显著蛋白质峰的任意组合中，采用SVM筛选出预测值的约登(youden)指数最高的组合模型，筛选出M/Z位于4263.1、4122.8、4330.7和4303.7的标志物4个，在肾母细胞瘤Ⅲ期组低表达，在肾母细胞瘤Ⅰ期高表达。联合两个潜在标记物作为输入值，用留一法交叉检验，在测试集上判别模型的敏感性为100.00％，特异性为100.00％。3．肾母细胞瘤Ⅰ肾母细胞瘤和肾母细胞瘤Ⅳ期组肾母细胞瘤Ⅰ组和肾母细胞瘤Ⅳ期的质谱经过初步过滤筛选得到565个M/Z峰，对其相对强度做Wilconxon秩和检验分析得到P值小于0.01的M/Z峰4个，从差异显著蛋白质峰的任意组合中，采用SVM筛选出预测值的约登(youden)指数最高的组合模型，筛选出M/Z位于10836.6和8179.1的标志物2个，在肾母细胞瘤Ⅳ期低表达，在肾母细胞瘤Ⅰ期高表达。联合两个潜在标记物作为输入值，用留一法交叉检验，在测试集上判别模型的敏感性为88.89％，特异性为100.00％。4．肾母细胞瘤Ⅱ肾母细胞瘤和肾母细胞瘤Ⅲ期组肾母细胞瘤Ⅱ组和肾母细胞瘤Ⅲ期的质谱经过初步过滤筛选得到490个M/Z峰，对其相对强度做Wilconxon秩和检验分析得到P值小于0.01的M/Z峰3个，从差异显著蛋白质峰的任意组合中，采用SVM筛选出预测值的约登(youden)指数最高的组合模型，筛选出M/Z位于5019.2和4143.2的标志物2个，在肾母细胞瘤Ⅲ期组低表达，在肾母细胞瘤Ⅱ期高表达。联合两个潜在标记物作为输入值，用留一法交叉检验，在测试集上判别模型的敏感性为88.89％，特异性为100.00％。5．肾母细胞瘤Ⅱ肾母细胞瘤和肾母细胞瘤Ⅳ期组肾母细胞瘤Ⅱ组和肾母细胞瘤Ⅳ期的质谱经过初步过滤筛选得到508个M/Z峰，对其相对强度做Wilconxon秩和检验分析得到P值小于0.01的M/Z峰20个，从差异显著蛋白质峰的任意组合中，采用SVM筛选出预测值的约登(youden)指数最高的组合模型，筛选出M/Z位于7976.5的标志物1个，在肾母细胞瘤Ⅳ期组低表达，在肾母细胞瘤Ⅱ期高表达。联合两个潜在标记物作为输入值，用留一法交叉检验，在测试集上判别模型的敏感性为100.00％，特异性为100.00％。6．肾母细胞瘤Ⅲ肾母细胞瘤和肾母细胞瘤Ⅳ期组肾母细胞瘤Ⅲ组和肾母细胞瘤Ⅳ期的质谱经过初步过滤筛选得到504个M/Z峰，对其相对强度做Wilconxon秩和检验分析得到P值小于0.01的M/Z峰12个，从差异显著蛋白质峰的任意组合中，采用SVM筛选出预测值的约登(youden)指数最高的组合模型，筛选出M/Z位于8194.4的标志物1个，在肾母细胞瘤Ⅳ期组低表达，在肾母细胞瘤Ⅲ期高表达。联合两个潜在标记物作为输入值，用留一法交叉检验，在测试集上判别模型的敏感性为93.75％，特异性为100.00％。7．肾母细胞瘤Ⅰ+Ⅱ肾母细胞瘤和肾母细胞瘤Ⅲ+Ⅳ期组肾母细胞瘤Ⅰ+Ⅱ期组和肾母细胞瘤Ⅲ+Ⅳ期的质谱经过初步过滤筛选得到519个M/Z峰，对其相对强度做Wilconxon秩和检验分析得到P值小于0.01的M/Z峰3个，从差异显著蛋白质峰的任意组合中，采用SVM筛选出预测值的约登(youden)指数最高的组合模型，筛选出M/Z位于4153.9,3257.6和3290.7的标志物3个，在肾母细胞瘤组Ⅲ+Ⅳ期低表达，在肾母细胞瘤Ⅰ+Ⅱ期高表达。联合两个潜在标记物作为输入值，用留一法交叉检验，在测试集上判别模型的敏感性为83.33％，特异性为93.75％。8．临床各分期的对照：通过肾母细胞瘤早期诊断模型中的2个m/z(6984.4，6455.5)血清标记物进行分析得出肾母细胞瘤各期情况如下：Ⅳ期相对于Ⅲ期低表达；Ⅲ期相对于Ⅱ期低表达；Ⅱ期相对于Ⅰ期低表达；Ⅰ期相对于正常儿童低表达；后者相对高表达；临床分期越晚M/Z强度就越低表达。9．盲法验证CT与蛋白质芯片分期的准确性：蛋白芯片分期如下：Ⅰ期6例，Ⅱ期10例，Ⅲ期10例，Ⅳ期4例，30例肾母细胞瘤各期均与病理分期相一致，各期符合率均为100.00％，CT分期与手术病理分期的对照：各期均被手术及病理所证实CT把病理Ⅲ期1例列入Ⅱ期，把病理Ⅳ期1例列入Ⅲ期，各期符合率依次为100.00％，85.00％，85.00％，75.00％。结论1．m/z位于5022.4 Da、7965.4 Da、8469.6 Da、4303.7 Da、4122.8 Da、4330.7 Da、4785.6 Da、10836.6 Da、8179.1 Da、5019.2 Da、4143.2 Da、7976.5 Da、8194.4 Da、3290.7 Da、4153.9 Da和3257.6 Da的蛋白质构成的SVM分期判别模型对肾母细胞瘤患儿的准确临床分期和制定合理的治疗方案均具有很好的应用价值。2．运用SELDI-TOF-MS技术结合SVM方法找出在正常儿童和肾母细胞瘤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的差异蛋白质标记物，他们M/Z强度是依次降低的，各期依次降低幅度比较明显(P＜0.05)；正常儿童和Ⅰ期均高表达，但Ⅰ期强度低于正常儿童；M/Z强度愈高，分期愈低，预后愈好。3．盲法验证模型：蛋白质芯片的分期比CT分期准确性高，与病理结果基本一致，可弥补CT分期在生物学特征定性问题上的缺陷和不足，构建的蛋白质特异性标记物在术前较准确地进行肾母细胞瘤的临床分期和定性，弥补临床辅助检查的不足。4．通过质谱法结合SVM所得出的M/Z峰值，更精确地从成千上万个峰值中筛选出特异性高、敏感性强的蛋白质标记物，为以后肾母细胞瘤的特异蛋白质的分离和提纯提供了一种全新的思路和依据。