论文部分内容阅读
背景及意义：
本研究拟基于小鼠中脑动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)的缺血再灌注模型、小鼠脑神经元体外OGD模型进行相关研究，旨在通过阐明Mint3通过何种方式调控AMPK/mTOR通路，进而影响缺氧神经元细胞的能量代谢过程，从而参与神经损伤;为缺血性卒中后神经元细胞能量代谢异常导致的相关损伤提供新的治疗靶点。
材料和方法
1.Mint3对小鼠缺血性卒中后神经损伤程度的影响
2.Mint3对经过OGD处理的小鼠神经元细胞死亡率的影响
3.缺血性卒中对AMPK/mTOR通路中核心分子表达的影响
4.Mint3对缺血性卒中后AMPK/mTOR通路中核心分子表达的影响
5.Mint3调控AMPK/mTOR通路的机制
结果：
1.Mint3减缓小鼠缺血性卒中的神经损伤程度
1.1 MCAO处理使Mint3的表达降低
1.2 Mint3减少MCAO处理后小鼠的脑梗死面积
1.3 Mint3降低MCAO处理后小鼠的行为学评分
1.4 Mint3减少了MCAO处理后小鼠大脑神经元细胞死亡和巨噬细胞浸润
2.Mint3降低OGD处理的小鼠神经元的死亡率
2.1 Mint3不影响MCAO处理后小鼠脑组织的炎症反应
2.2 Mint3降低OGD处理的小鼠神经元细胞LDH的释放
2.3 Mint3提升OGD处理的小鼠神经元细胞的细胞活性
综上所述:Mint3提升OGD处理后的小鼠神经元细胞CCK8的释放，提升了神经元细胞的细胞活性，发挥保护作用。
3.缺血性卒中对AMPK/mTOR通路中核心分子表达的影响
3.1 MCAO使脑组织的mTOR通路表达抑制且AMPK通路表达增强
3.2 OGD使原代神经元细胞的mTOR通路表达抑制且AMPK通路表达增强
3.3 OGD使PC12细胞的mTOR通路表达抑制且AMPK通路表达增强
综上所述，在脑组织、原代神经元细胞、PC12细胞中，受缺血性卒中的影响，p-mTOR、p-p70、p-4EBP1、AMPKα、Mint3的表达降低，p-AMPK的表达升高，表明mTOR通路活化受到抑制，而AMPK通路的活化则被增强。
3.4 Mint3和AMPKα增加PC12细胞的增殖速度
4.Mint3敲除对缺血性卒中后AMPK/mTOR通路中核心分子表达的影响
4.1 Mint3敲除使脑组织中mTOR通路表达抑制且AMPK通路表达增强
用Mint3-/-小鼠以及Mint3+/+小鼠进行MCAO手术，2h后，再灌注，24h后取小鼠脑梗侧大脑组织，进行处理，提取蛋白，使用Western blot检测:p-mTOR、p-p70、p-4EBP1、p-AMPK、AMPKα在蛋白水平的表达变化。Western blot结果显示经过MCAO处理后，Mint3的敲除导致p-mTOR、p-p70、p-4EBP1、AMPKα的表达降低，p-AMPK的表达升高。
4.2 Mint3敲除使原代神经元细胞的mTOR通路表达抑制且AMPK通路表达增强
用Mint3-/-小鼠以及Mint3+/+小鼠提取原代神经元细胞，OGD处理2h，复氧24h后，提取蛋白。使用Western blot检测:p-mTOR、p-p70、p-4EBP1、p-AMPK、AMPKα在蛋白水平的表达变化。Western blot结果显示经过OGD处理后，Mint3的敲除导致p-mTOR、p-p70、p-4EBP1、AMPKα的表达降低，p-AMPK的表达升高。
4.3 Mint3沉默使PC12细胞的mTOR通路表达抑制且AMPK通路表达增强
用转染试剂将对照l-siRNA和Mint3-siRNA分别转染入PC12细胞，并继续培养48h。OGD处理2h，复氧24h后，提取PC12细胞中的蛋白。使用Western blot检测通路中的分子。如p-mTOR、p-p70、p-4EBP1、p-AMPK、AMPKα在蛋白水平的表达变化。Western blot结果显示经过OGD处理后，Mint3的敲除导致p-mTOR、p-p70、p-4EBP1、AMPKα的表达降低，p-AMPK的表达升高。
综上所述:在经过MCAO处理的小鼠脑组织，OGD处理的原代神经元细胞以及PC12细胞中，Mint3的敲除增强了AMPK通路的活化，并抑制了mTOR通路的活化。
5.Mint3通过结合AMPKα调控AMPK/mTOR通路
5.1 Mint3与AMPKα结合
用PC12细胞，进行非OGD处理和OGD处理，OGD处理2h后进行复氧，进行免疫共沉淀实验。将提取物在放入IP缓冲液中，进行裂解。离心收集上清液，并与蛋白质G Plus-Agrose免疫沉淀试剂和Mint3特异性抗体一起孵育。温育6小时后，用IP缓冲液把磁珠洗涤五次，之后通过用样品缓冲液来洗脱免疫沉淀物，制成蛋白样品，使用Western blot检测结合情况。Western blot检测结果显示Mint3与AMPKα结合，不与AMPKβ结合。
5.2 Mint3与AMPKα共定位
用小鼠原代神经元细胞，培养成熟后，进行免疫荧光共聚焦实验。用编码Mint3-V5的质粒瞬时转染的原代神经元细胞培养24小时，进行非OGD处理和OGD处理，OGD处理2后进行复氧。加入Mint3以及AMPKα特异性一抗，用Rabbit Alexa Fluor633或Mouse Alexa Fluor488偶联的二抗染色，细胞核用DAPI染色。用共聚焦激光显微镜检查细胞。观察结果显示，Mint3与AMPKα共定位。
结论：
1.Mint3通过结合AMPKα，抑制AMPK的活化，从而促进mTOR通路的活化，助于缺血性卒中后神经元细胞的能量稳态调节。
2.Mint3通过调控AMPK/mTOR通路，减少缺血性卒中后神经元细胞的死亡，减缓脑缺血带来的损伤。
创新性及意义：
1.本研究揭示了Mint3在缺血性卒中后神经元细胞死亡中的作用，提示Mint3可通过调控AMPK/mTOR通路的表达参与缺血性卒中后神经损伤的调节。
2.本研究揭示了Mint3在缺血性卒中疾病进程中的作用，为脑卒中及相关疾病的治疗提示了新的可能靶标。
本研究拟基于小鼠中脑动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)的缺血再灌注模型、小鼠脑神经元体外OGD模型进行相关研究，旨在通过阐明Mint3通过何种方式调控AMPK/mTOR通路，进而影响缺氧神经元细胞的能量代谢过程，从而参与神经损伤;为缺血性卒中后神经元细胞能量代谢异常导致的相关损伤提供新的治疗靶点。
材料和方法
1.Mint3对小鼠缺血性卒中后神经损伤程度的影响
2.Mint3对经过OGD处理的小鼠神经元细胞死亡率的影响
3.缺血性卒中对AMPK/mTOR通路中核心分子表达的影响
4.Mint3对缺血性卒中后AMPK/mTOR通路中核心分子表达的影响
5.Mint3调控AMPK/mTOR通路的机制
结果：
1.Mint3减缓小鼠缺血性卒中的神经损伤程度
1.1 MCAO处理使Mint3的表达降低
1.2 Mint3减少MCAO处理后小鼠的脑梗死面积
1.3 Mint3降低MCAO处理后小鼠的行为学评分
1.4 Mint3减少了MCAO处理后小鼠大脑神经元细胞死亡和巨噬细胞浸润
2.Mint3降低OGD处理的小鼠神经元的死亡率
2.1 Mint3不影响MCAO处理后小鼠脑组织的炎症反应
2.2 Mint3降低OGD处理的小鼠神经元细胞LDH的释放
2.3 Mint3提升OGD处理的小鼠神经元细胞的细胞活性
综上所述:Mint3提升OGD处理后的小鼠神经元细胞CCK8的释放，提升了神经元细胞的细胞活性，发挥保护作用。
3.缺血性卒中对AMPK/mTOR通路中核心分子表达的影响
3.1 MCAO使脑组织的mTOR通路表达抑制且AMPK通路表达增强
3.2 OGD使原代神经元细胞的mTOR通路表达抑制且AMPK通路表达增强
3.3 OGD使PC12细胞的mTOR通路表达抑制且AMPK通路表达增强
综上所述，在脑组织、原代神经元细胞、PC12细胞中，受缺血性卒中的影响，p-mTOR、p-p70、p-4EBP1、AMPKα、Mint3的表达降低，p-AMPK的表达升高，表明mTOR通路活化受到抑制，而AMPK通路的活化则被增强。
3.4 Mint3和AMPKα增加PC12细胞的增殖速度
4.Mint3敲除对缺血性卒中后AMPK/mTOR通路中核心分子表达的影响
4.1 Mint3敲除使脑组织中mTOR通路表达抑制且AMPK通路表达增强
用Mint3-/-小鼠以及Mint3+/+小鼠进行MCAO手术，2h后，再灌注，24h后取小鼠脑梗侧大脑组织，进行处理，提取蛋白，使用Western blot检测:p-mTOR、p-p70、p-4EBP1、p-AMPK、AMPKα在蛋白水平的表达变化。Western blot结果显示经过MCAO处理后，Mint3的敲除导致p-mTOR、p-p70、p-4EBP1、AMPKα的表达降低，p-AMPK的表达升高。
4.2 Mint3敲除使原代神经元细胞的mTOR通路表达抑制且AMPK通路表达增强
用Mint3-/-小鼠以及Mint3+/+小鼠提取原代神经元细胞，OGD处理2h，复氧24h后，提取蛋白。使用Western blot检测:p-mTOR、p-p70、p-4EBP1、p-AMPK、AMPKα在蛋白水平的表达变化。Western blot结果显示经过OGD处理后，Mint3的敲除导致p-mTOR、p-p70、p-4EBP1、AMPKα的表达降低，p-AMPK的表达升高。
4.3 Mint3沉默使PC12细胞的mTOR通路表达抑制且AMPK通路表达增强
用转染试剂将对照l-siRNA和Mint3-siRNA分别转染入PC12细胞，并继续培养48h。OGD处理2h，复氧24h后，提取PC12细胞中的蛋白。使用Western blot检测通路中的分子。如p-mTOR、p-p70、p-4EBP1、p-AMPK、AMPKα在蛋白水平的表达变化。Western blot结果显示经过OGD处理后，Mint3的敲除导致p-mTOR、p-p70、p-4EBP1、AMPKα的表达降低，p-AMPK的表达升高。
综上所述:在经过MCAO处理的小鼠脑组织，OGD处理的原代神经元细胞以及PC12细胞中，Mint3的敲除增强了AMPK通路的活化，并抑制了mTOR通路的活化。
5.Mint3通过结合AMPKα调控AMPK/mTOR通路
5.1 Mint3与AMPKα结合
用PC12细胞，进行非OGD处理和OGD处理，OGD处理2h后进行复氧，进行免疫共沉淀实验。将提取物在放入IP缓冲液中，进行裂解。离心收集上清液，并与蛋白质G Plus-Agrose免疫沉淀试剂和Mint3特异性抗体一起孵育。温育6小时后，用IP缓冲液把磁珠洗涤五次，之后通过用样品缓冲液来洗脱免疫沉淀物，制成蛋白样品，使用Western blot检测结合情况。Western blot检测结果显示Mint3与AMPKα结合，不与AMPKβ结合。
5.2 Mint3与AMPKα共定位
用小鼠原代神经元细胞，培养成熟后，进行免疫荧光共聚焦实验。用编码Mint3-V5的质粒瞬时转染的原代神经元细胞培养24小时，进行非OGD处理和OGD处理，OGD处理2后进行复氧。加入Mint3以及AMPKα特异性一抗，用Rabbit Alexa Fluor633或Mouse Alexa Fluor488偶联的二抗染色，细胞核用DAPI染色。用共聚焦激光显微镜检查细胞。观察结果显示，Mint3与AMPKα共定位。
结论：
1.Mint3通过结合AMPKα，抑制AMPK的活化，从而促进mTOR通路的活化，助于缺血性卒中后神经元细胞的能量稳态调节。
2.Mint3通过调控AMPK/mTOR通路，减少缺血性卒中后神经元细胞的死亡，减缓脑缺血带来的损伤。
创新性及意义：
1.本研究揭示了Mint3在缺血性卒中后神经元细胞死亡中的作用，提示Mint3可通过调控AMPK/mTOR通路的表达参与缺血性卒中后神经损伤的调节。
2.本研究揭示了Mint3在缺血性卒中疾病进程中的作用，为脑卒中及相关疾病的治疗提示了新的可能靶标。