论文部分内容阅读
NK细胞不仅直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染的细胞,还分泌细胞因子调节机体的获得性免疫功能。树突状细胞(DC)是激活初始T细胞、启动特异性免疫应答的重要抗原递呈细胞。前期研究表明:NK细胞与树突状细胞(DC)之间的对话(crosstalk)不仅影响天然免疫功能,还对获得性免疫的形成及发展有深远的影响。DC激活NK细胞,并通过上调NK细胞的活性而增强其抗肿瘤作用。反之,活化的NK细胞促进DC成熟,并诱导Th0细胞向Th1方向发展,从而增强机体的免疫防御和免疫监视功能。MHC I类相关分子A(Major histocompatibility complex class I chain-related protein A,MICA),是NK细胞活化性受体NKG2D的配体,MICA与NKG2D结合后激活NK细胞,发挥其细胞毒活性和分泌IFN-γ等细胞因子。尽管单核细胞表面无MICA的表达,胞浆内却存在MICA分子。因此,本文试图研究MICA如何介导DC与NK细胞的相互作用,以及MICA参与DC与NK细胞之间的对话是否与结肠癌的免疫逃逸有关,从而深入探讨MICA参与肿瘤发病的机制。本研究分为三部分:第一部分:DC表达MICA对NK细胞活性的影响目的:观察单核细胞分化为DC时是否表达MICA,以及DC表达MICA后对NK细胞活性的影响。方法:首先分离正常个体和结肠癌患者外周血单个核细胞(PBMC),经重组GM-CSF、IL-4诱导为未成熟DC(iDC)。然后分别用LPS、TNF-α、CD40L、IL-15和IFN-α刺激成熟,流式细胞仪(FCM)检测MICA在单核细胞、iDC以及成熟DC(mDC)细胞表面的表达。并观察DC表达MICA后对NK细胞表达CD69、细胞毒活性和IFN-γ分泌的影响。最后分别利用重组NKG2D-Ig蛋白和IL-12抗体阻断实验观察对DC激活NK细胞的影响。结果:健康个体和结肠癌患者单核细胞均微量表达MICA,iDC表面MICA表达量均提高。与iDC相比,LPS、TNF-α和CD40L刺激的mDC表面MICA表达无明显变化,但IFN-α、IL-15可刺激健康个体的成熟DC上调表达MICA,却不能促进结肠癌患者的成熟DC上调MICA的表达。受IFN-α刺激成熟的DC促进NK细胞表达CD69、分泌IFN-γ、杀伤K562细胞。在DC激活NK细胞的培养体系中加入NKG2D-Ig蛋白可下调NK细胞毒活性和分泌IFN-γ,而加入IL-12抗体仅下调NK细胞分泌IFN-γ,对细胞毒功能无影响。结论:正常个体iDC和mDC细胞表面均表达MICA,IFN-α、IL-15刺激mDC上调MICA表达。DC表达MICA增强NK细胞活性,且其细胞毒活性的提高依赖于DC表面相关配体与NK细胞表面NKG2D的相互作用。结肠癌患者体内mDC低表达MICA可能是其免疫逃逸的机制之一。第二部分:受MICA刺激的NK细胞对DC活性的影响目的:观察固相MICA(iMICA)是否协同NK细胞对iDC的作用,以及受NK细胞攻击的MICA阳性靶细胞是否促进DC吞噬。方法:首先分别取异体新鲜分离的NK细胞、或受固相MICA刺激的异体NK细胞,以及IL-2、或IL-2联合iMICA刺激的自体NK细胞与iDC按5:1孵育,24小时后FCM分析CD86或HLA-DR阳性细胞频率。其次取自体NK细胞以IL-2、或IL-2联合iMICA刺激后按1:5比例与iDC孵育,24小时后FCM检测HLA-DR分子的表达变化,并通过IFN-γ抗体阻断实验观察iMICA刺激的NK细胞是否通过分泌IFN-γ促进DC成熟。最后分别将受LAK细胞攻击的、或丝裂霉素C处理的CFSE标记的K562、K562-MICA细胞,与iDC作用24小时后FCM检测HLA-DR与CFSE双阳性细胞频率。结果:当NK与iDC孵育比例为5:1时,同种异体新鲜NK细胞及自体活化NK细胞均能杀伤iDC,而固相MICA无协同作用。当NK与iDC孵育比例为1:5时,固相MICA协同自体NK细胞诱导iDC成熟,而加入IFN-γ抗体可以下调DC表达HLA-DR。当K562、K562-MICA细胞受LAK细胞攻击或丝裂霉素C处理后,K562-MICA细胞易被DC吞噬。结论:当IL-2活化的NK细胞杀伤iDC时,无需iMICA刺激。但固相MICA可以刺激NK细胞分泌IFN-γ促进DC成熟。MICA阳性的肿瘤细胞被NK细胞攻击后促进iDC吞噬。第三部分:结肠癌患者外周血单核细胞MICA表达与NK细胞相关表型的关联分析目的:比较结肠癌患者与健康个体外周血MICA表达的单核细胞频率,以及NKG2D、CD16、CD69阳性NK细胞频率的差异,并探讨体内单核细胞MICA表达与NK活性相关受体的表达是否存在关联。方法:取结肠癌患者以及健康个体外周血,常规分离PBMC,用不同颜色荧光单克隆抗体分别标记CD14/MICA,CD56/NKG2D,CD56/CD69,CD56/CD16,流式细胞仪分析双阳性细胞频率。利用直线相关回归分析单核细胞MICA表达频率与NK表达NKG2D及CD69频率的关联性。结果:结肠癌患者与健康个体外周血CD14+/MICA+单核细胞频率无明显差异。结肠癌患者CD56+/NKG2D+细胞,CD56+/CD69+细胞频率与健康个体相比明显下调,但CD56+/CD16+细胞频率无差异。另外,单核细胞MICA的表达与NK细胞NKG2D及CD69的表达无明显关联。结论:结肠癌患者与健康个体外周血MICA阳性的单核细胞频率均很低,结肠癌患者体内由NKG2D受体介导的NK细胞活性较健康个体明显降低,但外周血单核细胞MICA的表达与NK细胞功能无明显关联。综上所述,MICA分子直接不仅介导DC与NK细胞之间的对话,并在MICA阳性肿瘤患者体内发挥着激活NK细胞,诱导DC吞噬凋亡肿瘤碎片并交叉递呈抗原、启动特异性免疫应答的作用。因此,基于增强DC与NK细胞对话的生物治疗措施将具有显著的抗肿瘤效果。