论文部分内容阅读
背景:急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是临床上常见的急腹症之一,10%30%的患者会发展成重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）。急性肺损伤（acute lung injury,ALI）则是SAP中常见的并发症之一。胰管梗阻、胆汁反流、过量饮酒、微循环障碍、高脂血症、细菌感染是导致AP发生的主要原因,同时内毒素的移位、炎性细胞的激活、多种炎症因子的瀑布样级联反应等则会使其发展为全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）和多器官功能障碍综合症（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）。在AP过程中,由于PMN侵入肺部,胰弹力蛋白酶、NF-κB通路等的激活使肺部组织受损从而引发ALI。大量实验结果显示肺毛细血管内、肺间质及肺泡内的中性粒细胞（neutrophil,PMN）的数量与ALI/ARDS的严重程度呈正相关;PMN被抑制或清除,肺损伤的严重程度会明显的降低,否则,ALI将会迅速发生。以上这些都表明在相关的急性肺损伤的发展过程中PMN起到了非常重要的作用:（1）PMN活化后可以激活肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor,TNF-α）、白细胞介素1（Interleukin1,IL-1）、白细胞介素6（Interleukin 6,IL-6）等炎性因子和趋化因子中的白细胞介素8（Interleukin 8,IL-8）,炎性因子会降低PMN变形能力从而使其大量积压在肺内微血管中,并且PMN可以通过多种炎症通路使机体内更多炎性因子被激活导致级联反应,加重病情;IL-8则可以使PMN黏附内皮细胞的数量增加,引导PMN大量聚集到炎症位置,促使PMN释放有害物质对机体造成损伤;（2）PMN释放损伤性酶如胶原酶、组织蛋白酶、弹性蛋白酶等,胶原酶可以降解和消化肺组织中的结构蛋白,使肺泡毛细血管的基底膜受到破坏;组织蛋白酶可以降低内皮细胞的表面抗凝力使PMN更易黏附,并使凝血功能受损;弹性蛋白酶可以改变肺泡通透性引起肺水肿,破坏肺微血管内皮细胞使PMN更易通过,破坏肺泡上皮细胞引起表面活性降低,破坏凝血因子造成凝血障碍（3）PMN可以降低血浆对活性氧自由基的抵抗作用,使活性氧自由基增多,对机体的脂质和蛋白质造成不同程度的损伤,其氧代谢产物可以使脂质发生过氧化反应从而对生物膜脂质造成损害,还可以通过改变蛋白质结构和酶的活性来影响膜蛋白,也可以使细胞发生死亡或是降低机体的抗氧化能力;（4）PMN影响ALI/ARDS是通过对NF-κB通路的调控作用。在SAP-ALI中,PMN发生黏附,游出,并大量聚集在炎症部位。细胞粘附分子1（ICAM-1）与CD11/CD18相互作用,提高了内皮细胞与PMN的相互作用。PMN通过释放炎症因子损伤肺泡上皮细胞,致其通透性增大,肺表面活性物质被分解,从而使肺泡顺应性降低、表面张力增加,使吸气时消耗更多能量。由于PMN向炎症部位聚集,组织中PMN的数量也将随之增加,而且其中的炎症介质使其凋亡锐减,这就使PMN持续被激活,最终引起SIRS。由于IL-8的作用CD11/CD18会从PMN的细胞内库转移到细胞表面,同时PMN表面的L-选择素也会因为IL-8的影响发生脱落、变形。IL-8作为CXC趋化家族蛋白之一,其核转录因子-κB（NF-κB）的结合位点与IL-6相近,可在TNF-α的诱导下由血管内皮细胞（VEC）产生。骨髓中的PMN可在IL-8的刺激诱导下向外周血释放。IL-8与CXCR1/CXCR2结合后,趋化PMN移动到创伤位置并与VEC粘附,从而加重炎症反应。本课题组多年的临床和基础实验研究表明,中药清胰汤具有通里攻下、清热解毒、活血化瘀、疏肝理气的功效,能有效地防治急性胰腺炎及其所引起的肺损伤,目前已广泛应用于临床并取得了良好的效果。其组方中的大黄和柴胡是通里攻下、疏肝理气之主药,也是《金匮要略》经典方--大柴胡汤的组成药味,为治疗少阳阳明证的经典方剂。多年来的研究证实,清胰汤可以抑制AP所致炎症反应的加重,保护主要器官,防止其功能衰竭。尽管清胰汤治疗SAP的实验研究和临床观察被广泛报道,且AP的发病机理的研究以及清胰汤的治疗作用已经取得了较大的进展,但AP-ALI的发病机理及清胰汤的但其具体干预机制尚未完全明了,特别是众多炎症因子基因及蛋白的表达、信号传导以及相互关系还需进一步深入探讨。在本试验中,我们使用经过对清胰汤进行剂型改革制成的颗粒剂——清胰颗粒代替清胰汤进行相关观察研究。目的:本实验应用经胆胰管逆行注射脱氧胆酸钠来制备大鼠急性胰腺炎模型,探究IL-8对中性粒细胞的趋化机制及其在急性胰腺炎肺损伤发病机制中的作用,并观察清胰颗粒的干预作用,为临床上用中西医结合的方法治疗重症急性胰腺炎及其相关性肺损伤提供可靠的实验依据及理论基础。方法:将50只SPF级雄性SD大鼠随机分成5组:正常对照组（SHAM组）8只,重症急性胰腺炎模型组（SAP组）10只,IL-8抗体组（IL-8 Ab组）10只,地塞米松组（DEX组）10只,清胰颗粒组（QYKL组）12只。SHAM组仅开腹翻动胰腺数次;SAP模型组采用15g/L脱氧胆酸钠（1m L/kg体质量）经胆胰管逆行注射法制备SAP动物模型;IL-8 Ab组为造模后立即经尾静脉注射给予IL-8抗体干预;DEX组为造模后立即经腹腔给予5g/L地塞米松注射液;QYKL组为造模前30min用清胰颗粒水溶液进行灌胃。所有组别的大鼠于手术后24小时进行处死、取材,将部分肺和胰腺组织进行苏木精—伊红（hematoxylin-eosin staining,HE）染色并进行相应的病理评分;使用真空干燥法测量肺组织的湿/干比值;先用经肝素润过的5mL注射进行腹主动脉取血,抽取2m L后拔出迅速封闭注射器并送往检验科进行血气分析,同时用血管夹夹死动脉;然后用新的5m L注射器在血管夹上侧插入继续取血,提取血清并用ELISA法来测定其中TNF-α、IL-8的含量;全自动生化分析仪检测血清淀粉酶的含量;Western-Blot法检测肺组织中ICAM-1蛋白水平的表达;应用RT-qPCR检测肺组织中ICAM-1基因水平的表达。结果:与SHAM组相比,SAP组大鼠肺和胰腺组织的病理评分均升高（p<0.05）,符合SAP-ALI的病理学特征;SAP组动脉血PaO2明显降低（p<0.05）,PaCO2显著升高（p<0.05）;SAP组大鼠的肺组织的湿/干比值显著升高（p<0.05）;SAP组大鼠血清TNF-α、IL-8的含量均上升（p<0.05）;肺组织的ICAM-1蛋白表达水平升高（p<0.05）;肺组织中ICAM-1的基因表达水平也有所升高（p<0.05）。与SAP组相比,中药治疗组及IL-8和地塞米松处理组各项指标均有不同程度改善,但可以看到,IL-8和地塞米松不仅作用单一且有一定的副作用,而清胰汤则具有多方面、多层次、多靶点的综合治疗效应。结论:（1）造模后模型组大鼠胰腺和肺组织出现明显病理改变,血清淀粉酶明显升高,血气分析出现明显变化,肺湿/干比值明显升高,模型大鼠发生急性胰腺炎并出现了肺损伤,表明急性胰腺炎肺损伤模型制备成功。（2）清胰颗粒可能通过抑制IL-8的趋化活性,减轻中性粒细胞在肺组织的聚集从而达到减轻胰腺和肺组织超强的炎症反应,进而达到减轻肺损伤的目的。清胰颗粒在急性胰腺炎肺损伤的防治上具有明显的综合治疗效应。