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DNA甲基化(DNA methylation)是指生物体在DNA甲基转移酶(DNA methyltran sferase，DNMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体将甲基转移到特定的碱基上的过程。DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶，6-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤，在真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶。大量研究表明，在高等植物中DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而参与调控许多重要的生物学现象和发育过程。
发现DNA甲基化可能是调控陆地棉中一个新发现的年周期生长节律(annual growth rhythm)现象的重要机制。在研究陆地棉纤维发育机制的过程中，本实验室进行了大量的胚珠体外培养实验，对于不添加任何外源化学试剂的对照组(CK)，体外培养6天后的纤维长度在一年的不同月份中却有显著差异，每年1月～2月约为1.3±0.1毫米到7月～8月的约4.3±0.2毫米。综合分析2007到2009连续3年的数据表明，陆地棉中存在一个可重复的以物理年为单位的周期生长节律。
对不同月份收取的陆地棉+7天胚珠材料RNA样品进行cDNA微阵列杂交分析，得到了235个有季节显著(>2倍，P<0.001)差异表达的基因(202个8月高调基因和33个2月高调基因)。通过GOEAST(Gene Ontology Enrichment Analysis Software Toolkit)软件分析找到了这235个差异基因代表的富集代谢通路。综合分析发现，DNA甲基化现象(gene ontology term，GO term，DNA methylation)处于中心位置，在14个富集通路中有6个可以分别定义到DNA甲基化的上游或下游。
对注释进DNA甲基化(GO ID：0006306)现象的5个显著差异表达基因进行全长扩增，序列比对和进化树等一系列分析表明，它们分别编码了2个甲基化酶，Domains Rearranged Methylase1/2(DRM1/2)和Chromomethylase3(CMT3)，2个去甲基化酶，DEMETER(DME)和Repressor Of Silencing1(ROS1)以及1个参与RNA介导的DNA甲基化(RNA-directed DNAmethylation，RdDM)过程的dicer-like家族蛋白DCL3。实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，QRT-PCR)分析表明这5个基因的表达丰度存在年周期节律变化，并且参与甲基化过程的酶在8月达到最低，2月达到最高，反之参与去甲基化过程的酶在8月最高，2月最低。选取其中表达丰度最高且功能最重要的2个酶DRM1/2和ROS1合成了抗体，Western杂交分析进一步表明了其蛋白丰度也存在年周期节律变化，与基因表达丰度变化规律一致。在胚珠体外培养实验中，通过外源添加能改变胚珠甲基化水平的试剂可以消除年周期节律现象，8.5μM的促甲基化试剂SAM可以抑制8月材料的纤维长度降低到2月的水平，证实了DNA甲基化可能调控陆地棉中年周期节律现象。
对于陆地棉纤维发育重要基因3-酮脂酰.辅酶A合酶(3-ketoacly-CoAsynthase，KCS)的启动子区进行bisulfite测序分析其甲基化分布情况，2月，5月，8月和11月材料均测序得到17个独立的bisulfite克隆。该区段共299 bp，41个C位点，2个CG位点，8个CHG位点和31个CHH位点(H=A，C或者T)。分析bisulfite测序结果发现，2个CG位点和7个CHG位点在所有样品中都保持高甲基化状态(>76％)，1个CHG位点在所有样品中都保持不甲基化状态，而甲基化水平发生周期节律变化集中于CHH位点。对其中一个甲基化水平存在周期节律变化的CHH位点进行甲基化敏感的酶切Southern杂交和PCR分析证实了该位点的周期性甲基化水平差异，2月最高，8月最低，与bisulfite测序结果一致。同时甲基化DNA免疫沉淀QRT-PCR(Methylated DNAImmunoprecipitation coupled with QRT-PCR，MeDIP-qPCR)实验也表明KCS启动子区在2月有较多的甲基化胞嘧啶，而8月较少。作为对照，对GAE的一个CG位点和SUR4的一个CHG位点进行了甲基化敏感酶切PCR的验证，发现不同时间点材料没有显著的差异，说明该CG和CHG位点甲基化水平在一年的周期中是不变的。
通过遗传学手段也可以改变陆地棉的年周期生长节律。构建了去甲基化酶ROS1的RNAi转基因载体，得到3个不同的RNAi株系。QRT-PCR和Western杂交分析表明在3个转基因株系中都可以看到ROS1基因表达丰度和蛋白水平的显著下降。取不同月份的材料进行胚珠体外培养并测量纤维长度，结果发现RNAi植株中，年周期生长节律被减弱了。8月份体外培养纤维长度最高为2.9±0.2毫米，对应于空载体组的3.9±0.3毫米，说明ROS1基因通过影响DNA甲基化水平参与陆地棉年周期生长节律现象的调控。Bisulfite测序结果分析也表明，与亲本株系相比较，在转基因植株中甲基化水平显著提高。
我们的数据表明DNA甲基化模式的年周期节律变化可能参与调控陆地棉年周期生长节律现象。