出血性脑卒中是致死和致残率最高的脑血管病,且预后多有严重的神经功能障碍等后遗症。过去针对脑出血的研究大多以单一神经元为靶点,考察其发生与发展过程中的生化损伤,如缺氧、兴奋性氨基酸毒性、自由基损伤、红细胞裂解代谢产物、炎症反应等。除此之外,脑出血过程中还存在着瞬时血流冲击应力、剪切应力以及血肿长期的占位挤压应力(血肿应力)等。而这些不容忽视的应力在高血压脑出血的发生与发展过程中是否发挥着重要作用,却鲜有报道。因此本课题以脑组织切片(脑片)为模型,重点探讨了高血压脑出血后,血肿应力对组织损伤的初步过程,并通过神经元培养实验加以验证。基于生物力学探讨神经组织损伤机制,能为进一步认识出血性脑卒中发生发展的过程提供新的视角,能为该领域临床干预和新药研发提供新的思路。本文主要研究内容及结果如下:(1)构建并评价了脑片应力加载培养体系。本课题采用微孔滤膜培养法,利用Transwell细胞培养小室进行脑组织切片培养,并以密闭应力加载装置对组织切片及细胞进行应力加载,构建了切片及细胞应力加载培养体系。通过正置相差显微镜、乳酸脱氢酶酶标以及促凋亡基因BAX定量PCR等手段,对切片最佳培养条件、活性窗口期进行考察。结果表明,切片最佳活性窗口期为2~6天,最佳换液时间间隔为24h,损伤应力加载大小为40kPa。(2)探讨了静压力对脑片损伤的初步过程。1)通过对神经元特异性标志物神经元烯醇化酶(NSE)、神经胶质细胞特异性标志物胶质细胞酸性蛋白(GFAP)以及神经元骨架结构蛋白β-III的免疫荧光染色,发现在应力加载后,神经元及胶质细胞活性减弱;2)采用荧光定量PCR技术分别对PIEZO家族、TRPV4等阳离子通道基因的信使RNA(mRNA)在应力加载前后进行定量检测。结果表明,应力加载后,mRNA含量迅速上升,撤去应力培养一段时间后mRNA含量再次显著上升;3)通过westernblot技术分别测定了应力加载前后PIEZO家族、TRPV4蛋白表达量,发现其蛋白表达量在应力加载后迅速升高。与基因检测的结果不同,继续培养一段时间后,其表达量并没有继续升高,反而呈现下降的趋势;4)PIEZO家族蛋白以及TRPV4阳离子通道蛋白表达的上调,会使细胞内外阳离子浓度发生变。钙离子荧光探针结果表明,应力加载后,Ca2+内流,细胞内Ca2+浓度升高。过高的胞内Ga2+浓度将会激活促凋亡基因的表达;5)最后通过荧光定量PCR技术,对应力加载后促凋亡基因BAX以及抑制凋亡基因Bcl-2的mRNA含量进行检测,以表征切片活性。结果显示,应力加载后,BAX基因mRNA含量迅速上升,Bcl-2基因急剧下降,并在撤去应力后仍然保持此趋势,表明切片活性随着在应力加载后急剧下降,与免疫荧光实验结果一致。(3)神经元细胞应力加载,进一步补充和验证了基于脑片应力加载的损伤途径。实验表明,应力加载后,培养体系中LDH浓度立即升高,而切片培养体系中LDH浓度先降低,再升高;TRPV4、PIEZO家族离子通道蛋白表达量迅速上升,撤去应力后,其表达量立即下降。其次,静压力的加载,直接或间接的影响了骨架微管蛋白β-III的表达,且其表达量的变化与应力响应离子通道蛋白一致。而微管蛋白作为维持细胞形态,承受外来静压力的主要结构,其表达量随着应力加载而升高对保护细胞有着重要作用。上述实验结果表明,应力加载后,应力响应的离子通道蛋白TRPV4、PIEZO等表达量上调,导致Ca2+内流增加,细胞内Ca2+离子浓度的升高,激活促凋亡基因BAX等的表达,同时拮抗抑制凋亡基因Bcl-2的表达,诱导细胞凋亡,从而造成脑组织的损伤。