牛奶中含有丰富的营养物质和活性蛋白,对人体健康非常有益。为了消除牛奶中的致病微生物并延长货架期,需要对牛奶进行一定程度热加工处理。乳过氧化物酶具有抑菌功能,是牛奶中热稳定性最强的酶之一,可用来监测巴氏杀菌乳的热处理程度。本研究建立了快速定性检测牛奶中乳过氧化物酶活性的方法,并使用试验牛奶样品和市售牛奶样品。研究了热处理强度对巴氏杀菌乳中乳过氧化物酶活性的影响,并对北京市场销售的巴氏杀菌奶中的乳过氧化物酶活性进行了检测,为牛奶加工生产和牛奶质量评价提供了基础数据;建立了一种快速、高效、低成本的乳过氧化物酶蛋白纯化工艺,为其检测方法的验证及标准品的制备提供了基础材料。主要试验内容和结果如下:(1)牛奶中乳过氧化物酶活性快速检测方法的建立:利用显色试剂在过氧化氢的酶促反应下的颜色的变化来检测乳过氧化物酶活性,分为碘化钾试验法和对苯二胺试验法,并根据响应面分析结果优化试剂添加量。碘化钾法定量限为1400 U/L;检测批次内批次间精密度较好,变异系数小于10%;试剂有效期为20天。对苯二胺法定量限为370 U/L;检测批次内批次间精密度较好,变异系数均小于10%;试剂有效期为14天。将两种试验方法在不同乳过氧化物酶活性条件下反应的不同颜色制作成比色卡,可以判断0至3800 U/L左右的乳过氧化物酶活性值。本试验建立的方法可用于不同加工处理方式所得巴氏杀菌乳样品中乳过氧化物酶的快速检测。(2)不同热处理条件下牛奶中乳过氧化物酶活性研究:生鲜乳在72℃、75℃~120℃(每5℃一个梯度)条件下分别加工15s,利用乳过氧化物酶快速检测方法进行颜色反应测定并研究色度值与乳过氧化物酶活性的关系。试验结果表明,碘化钾试验法通过色坐标白度L*、黄度b*的变化趋势可判断出生乳及80℃以下热处理牛奶中乳过氧化物酶活性随温度升高而递减,而80℃以上热处理牛奶中乳过氧化物酶活性丧失。对苯二胺试验法可通过白度L*、红度a*、黄度b*判断出相同的结果。(3)市场中的巴氏杀菌奶中乳过氧化物酶活性研究:在北京连锁超市采集15批次巴氏杀菌乳,并对这些牛奶进行检测,分析其乳过氧化物酶活性。结果表明,只有2批次巴氏杀菌奶中乳过氧化物酶呈阳性,多数都存在过热加工的风险,建议将乳过氧化物酶的检测纳入巴氏杀菌乳相关的国家标准中。(4)乳过氧化物酶蛋白纯化工艺的建立:通过硫酸铵浓度梯度试验沉淀杂蛋白,筛选出最优的硫酸铵沉淀浓度为50%。使用5种疏水层析筛选预装柱,筛选出最优的纯化乳过氧化物酶疏水层析填料为Octyl Sepharose 4 FF。利用最优条件纯化牛奶中的乳过氧化物酶,所得纯度大于90%。本试验为乳过氧化物酶检测方法的验证及其标准品的制备提供了基础材料。本文建立的巴氏杀菌乳中乳过氧化物酶的快速检测方法无需进行乳品的前处理,不依赖大型仪器设备以及复杂的检测操作步骤,简便快捷高效,能够满足乳品现场收购、前加工处理工艺控制、乳品验收和检测中快速检测的需求。同时,建议将乳过氧化物酶的检测纳入巴氏杀菌乳相关的国家标准中。