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【背景】我们先前在研究胃癌多药耐药的分子机制中,发现朊蛋白(PrPc)与胃癌耐药表型密切相关,但其具体机制有待于进一步研究。PI3K/Akt途径通过改变下游分子的磷酸化状态直接调节细胞的增殖、生长及凋亡,并与肿瘤的多药耐药存在密切关系。有研究发现,PrPc可通过激活PI3K/Akt途径保护神经元免受凋亡。为探讨PrPc介导的胃癌耐药与PI3K/Akt途径的相关性,本研究检测了PrPc和p-Akt在胃癌组织和癌旁组织中的表达,建立了稳定转染PrP基因的胃癌细胞系,同时分析PI3K选择性抑制剂对PrPc转染胃癌细胞耐药性的影响及机制。旨在进一步阐明PrPc介导胃癌耐药的具体机制,并为探讨胃癌耐药表型的转化机制、寻找新的调控靶点提供一定的理论依据。【目的】1、分析PrPc及p-Akt在胃癌及癌旁组织中的表达及其相互关系。2、研究Akt在稳定转染PrP基因的胃癌细胞中的表达。3、探讨PI3K选择性抑制剂对稳定转染PrP基因的胃癌细胞的耐药表型的作用及机制。【方法】1、免疫组化检测PrPc和p-Akt在胃癌及癌旁组织中的表达,并分析两者的相互关系。2、脂质体基因转染法将PrP基因的真核表达载体转入胃癌细胞SGC7901,G418筛选稳定表达的细胞克隆并鉴定。3、Western -blot检测PrP转染细胞及其转空载体对照细胞中Akt蛋白的表达。4、噻唑蓝(MTT)比色法测定PI3K抑制剂LY294002对转染细胞体外药物敏感性的影响。5、流式细胞仪检测LY294002影响转染细胞药物诱导凋亡情况及细胞内阿霉素蓄积和潴留的变化。6、Western blot和RT-PCR检测LY294002作用后转染细胞耐药相关分子P-gp、Bcl-2蛋白及mRNA表达水平的变化。7、构建含MDR1启动子的荧光素酶报告基因质粒,并检测LY294002对转染细胞荧光素酶活性的影响。【结果】1、胃癌标本中PrPc阳性率为82.4%,p-Akt为88.2%。胃癌细胞中PrPc和p-Akt主要定位于细胞质和细胞膜中。相关性分析发现胃癌组织中PrPc和p-Akt表达的相关系数0.514(P<0.01),并且PrPc和p-Akt表达都和组织的分化程度相关(rs= 0.548, P<0.01;rs= 0.69, P<0.01) ,肿瘤组织分化程度越低,PrPc和p-Akt表达越强。2、建立了PrP基因稳定转染的SGC7901/PrP细胞,Western blot证实p-Akt在SGC7901/PrP细胞中的表达水平较转空载体对照细胞及亲本细胞明显增高。3、MTT法体外药物敏感性检测发现,LY294002以剂量依赖的方式增强转染细胞对化疗药物的敏感性,当经30μmol/L LY294002作用后,SGC7901/PrP细胞对化疗药物的半数抑制浓度IC50值接近对照细胞。4、流式细胞仪检测显示LY294002呈剂量依赖性增强转染细胞对化疗药物诱导的凋亡,增加转染细胞内阿霉素蓄积和潴留。5、LY294002可从mRNA及蛋白水平抑制SGC7901/PrP细胞中耐药分子P-gp及Bcl-2的表达,但对其对照细胞的作用不明显。6、成功构建含MDR1启动子的荧光素酶报告基因质粒,荧光素酶活性测定显示,SGC7901/PrP细胞中的荧光素酶活性较空载体对照明显升高,LY294002则明显降低转染细胞的荧光素酶活性。【结论】1、PrPc与p-Akt均在胃癌的发生发展中起着重要作用:PrPc与p-Akt在胃癌组织和癌旁组织中表达高度一致,两者均与胃癌组织的分化程度相关。在转染PrP基因的胃癌细胞中,p-Akt表达上调,提示PrPc可激活PI3K/Akt信号途径。2、抑制PI3K/ Akt途径活性可逆转PrPc介导的胃癌耐药:PI3K抑制剂LY294002可增强PrPc转染细胞的化疗药物敏感性、增加其对化疗药物诱导的凋亡、增加细胞内化疗药物的蓄积和潴留。提示抑制PI3K/ Akt途径活性可逆转PrPc介导的胃癌耐药,从而证实PrPc介导的胃癌耐药与PI3K/ Akt密切相关。3、抑制PI3K/ Akt途径活性可降低耐药分子P-gp及Bcl-2的表达: LY294002可降低PrPc转染细胞内耐药分子P-gp及Bcl-2蛋白及mRNA水平的表达,而对转空载体对照细胞的作用则不明显。通过构建含MDR1启动子的荧光素酶报告基因质粒,结果显示LY294002可降低PrPc转染细胞的荧光素酶活性值,而对转空载体对照细胞的作用则不明显。提示PrPc可能通过激活PI3K/Akt活性增强耐药分子P-gp及Bcl-2的表达。