毛果杨bHLH基因家族识别及PtrbHLH142基因功能分析

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在植物中碱性螺旋环螺旋(bHLH)在数量上是一类仅次于MYB转录因子的超级家族,它调控植物生长发育、传导信号、参与逆境防御等作用。然而,大部分bHLH转录因子功能是在草本植物内(如拟南芥、水稻)被鉴定的。在林木中bHLH转录因子家族信息及功能被报道较少,关于研究bHLH转录因子参与木材形成是有必要的。本研究鉴定了毛果杨bHLH转录因子家族成员,初步分析了PtrbHLH142的功能,取得的主要结果如下:(1)基于拟南芥bHLH成员氨基酸序列同源性比对,鉴定出毛果杨基因组存在196个bHLH成员,根据在染色体上的物理位置,命名为PtrbHLH1-PtrbHLH196,家族成员间分子质量及等电点差异较大,具有跨膜结构域的成员仅有一个。对毛果杨、拟南芥等bHLH家族成员构建了系统进化树,显示bHLH落在20个进化分枝上,分为20个亚类。(2)用MEME对毛果杨bHLH家族成员氨基酸序列进行motif分析,发现同一亚家族的成员motif结构相似,不同亚家族成员之间motif结构差异较大。通过Pfam分析发现motif1和motif2是bHLH转录因子保守结构域片段,用NCBI-CDD对这些成员的氨基酸序列分析,发现41个成员不但具有bHLH结构域,在其氨基酸序列上还嵌合其他转录因子结构域。(3)用eFP及Aspwood分析了毛果杨bHLH转录因子的组织表达模式,eFP数据显示PtrbHLH72、PtrbHLH95、PtrbHLH126和PtrbHLH128在木质部组织高丰度表达,结合Aspwood数据发现PtrbHLH72、PtrbHLH61、PtrbHLH142在次生木质部成熟后期高丰度、特异表达。对这三个成员进行RT-PCR验证,发现只有PtrbHLH142在木质部特异性表达,且在次生木质部成熟后期高丰度表达。实验构建了35S::PtrbHLH142-YFP载体,利用PEG介导法将它转化进毛果杨叶片原生质体,激光共聚焦显微镜进行观察显示PtrbHLH142是一个定位于细胞核转录因子。(4)为了鉴定PtrbHLH142的功能,实验构建了35S::PtrbHLH142过表达载体,利用农杆菌介导法转化毛果杨茎段,对抗性芽进行DNA分子鉴定以及转入基因的转录表达分析后,获得11个转基因株系,其中8个株系表达水平较高。用扫描电镜观察了直立生长2月龄的PtrbHLH142过表达毛果杨的第7茎节横切面,发现与野生型植株相比过表达PtrbHLH142植株茎次生木质部纤维细胞壁发育出较厚胶质层(G层),表明PtrbHLH142参与了毛果杨次生木质部纤维细胞壁胶质层的形成。综上,本研究对毛果杨bHLH转录因子家族进行了识别与分类,并分析了各成员组织内的表达模式,筛选出PtrbHLH142在次生木质部成熟后期高丰度表达,初步鉴定出PtrbHLH142参与了毛果杨次生木质部纤维细胞壁胶质层的形成。
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