马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata是我国重要的检疫性害虫,严重威胁我国马铃薯的生长。马铃薯甲虫是典型的全变态昆虫,各个虫态之间的转变受激素的调控,其中主要是蜕皮激素（20E）和保幼激素（JH）。在变态过程中除了形态和外表的变化,其内部的组织和器官也进行一系列的变化。因此,明晰变态过程中激素调控网络及其关键节点因子,具有重要的理论意义和潜在的应用价值。昆虫Taiman与Met形成二聚体介导JH信号,调控幼虫发育,阻止提前变态;Taiman作为20E受体复合物EcR/USP的共激活因子,也参与调控昆虫的生殖活动。然而,目前尚不清楚Taiman是否参与幼虫-蛹变态过程中20E信号的转导。本文集中探讨了 Taiman介导保幼激素（JH）和20-羟基蜕皮酮（20E）信号及其下游转录因子HR4、E74在生长和变态中所起的作用。主要结果如下:1.Taiman调控幼虫的生长发育鉴定了马铃薯甲虫bHLH-PAS家族的转录因子Taiman的5个剪接体及其外显子组成。Taiman蛋白N端具有保守的bHLH-PAS结构域,在中间区域具有LxxLL基序。Taiman在幼虫的不同组织和不同阶段的幼虫中均有表达,这预示着其在幼虫生长发育的重要性。在Taiman的5个剪接体的共同区域设计并合成dsTai序列,浸渍马铃薯叶片,连续三天喂食三龄（次末龄）幼虫,导致20%试虫在幼虫期死亡,其余的80%试虫化蛹失败。幼虫期的死亡是由于表皮和气管蜕皮异常。残留的体壁碎片附着在口器和足上,从而妨碍了幼虫取食,减少了营养吸收,降低了脂肪储存。营养缺乏最终导致幼虫死亡。化蛹失败是由于干扰Taiman扰乱保幼激素（JH）和20-羟基蜕皮酮（20E）信号,导致发育和营养平衡紊乱。试虫体内海藻糖代谢被抑制、几丁质含量降低、糖原和脂肪过度积累。此外,喂食二龄初幼虫dsTai菌液,导致相似幼虫死亡率和化蛹失败率。因此,马铃薯甲虫LdTai介导JH和20E途径,对幼虫的正常生长与蜕皮至关重要。2.Taiman调控幼虫-蛹变态的分子机理本章发现,马铃薯甲虫LdTai的表达量与血淋巴中循环的JH和20E滴度相一致。体外施加JH或20E显著诱导LdTai的表达。干扰四龄（末龄）幼虫LdTai同时抑制了JH和20E信号转导。尽管沉默了LdTai的幼虫体内JH和20E的滴度升高,但是其下游信号转录因子的表达显著受到抑制。由于JH信号转导受到抑制,与对照相比,干扰后幼虫的生长受阻,幼虫发育时间显著缩短。由于20E信号转导受到抑制,沉默了LdTai的幼虫全部蜕皮失败,并最终死亡。剥去未蜕下的表皮,可以看到蛹期胸部结构。除此之外,干扰后的幼虫在幼虫到蛹的变态过程中,气管蜕皮和脂肪体重塑均未完成。施加JH或20E均无法回补干扰LdTai所造成的化蛹失败。因此,马铃薯甲虫LdTai能同时介导幼虫到蛹变态过程中JH和20E信号转导。在JH信号转导中,LdTai与LdMet形成异源二聚体,调控下游基因的转录;在20E信号转导中,LdTai作为20E受体复合物EcR/USP的共激活因子,参与调控下游转录因子如E74和HR4的表达。3.LdHR4介导幼虫-蛹变态过程中20E的合成和信号转导鉴定了马铃薯甲虫LdHR4的两个可变剪接体LdHR4X1和LdHR4X2。LdHR4X1在前胸腺和表皮中高表达,LdHR4X2主要在神经系统中表达。两种LdHR4可变剪接体的时间表达与血淋巴中循环的20E峰值一致。活体实验表明,PTTH抑制前胸腺中LdHR4的表达,而20E则诱导体内LdHR4的转录。干扰四龄（末龄）幼虫LdHR4,2个20E合成基因LdDIB和LdSHD的表达量和20E滴度显著上升。4个20E信号转导基因LdEcR-A、LdEcR-B、LdE75和LdHR3的表达量上调,而LdFTZ-F1表达量下调。干扰LdHR4的幼虫死亡率上升、体重减轻、发育加快。干扰后幼虫尽管可以入土但是却不能完成幼虫到蛹的蜕皮,最终全部死亡。干扰LdHR4同时喂食保幼激素类似物吡丙醚,显著回补蜕皮激素合成基因表达量、幼虫的死亡率、发育历期及体重。部分回补幼虫死亡率,但是对化蛹失败率和LdFTZ-F1表达量没有回补作用。因此,末龄马铃薯甲虫LdHR4在幼虫-蛹变态过程中具有双重功能:其一是在前胸腺中参与20E的合成,其二是在外周组织中作为信号转录因子参与幼虫到蛹20E信号的转导。4.LdE74调控化蛹和附肢生长的分子机理鉴定了马铃薯甲虫LdE74的两个可变剪接体LdE74A和LdE74B。其相应蛋白质C端均具有相同的ETS DNA结合域,但N端序列则显著不同。在幼虫发育阶段,LdE74A和LdE74B的转录水平与血淋巴中循环的20E滴度一致。体外中肠20E孵育及活体喂食20E后,LdE74A和LdE74B的表达量均显著上调,并且二者表达模式一致。干扰LdEcR显著下调LdE74A和LdE74B的mRNA水平,而干扰LdE75无显著变化。在两个可变剪接体共同区域设计dsRNA,同时沉默两个可变剪接体。结果显示,干扰四龄（末龄）幼虫LdE74导致蜕皮失败,大部分停滞在预蛹阶段。去除幼虫旧表皮可见成虫阶段的一些结构和特征已形成。与对照相比,干扰LdE74的虫体附肢如触角、腹足和翅均显著缩短。少部分干扰LdE74的虫体发育为畸形蛹,同时其触角和腹足也显著变短。此外,无论是否干扰LdE74,摄入20E均会减少幼虫鲜重,缩短幼虫发育历期。干扰LdE74并不影响20E诱导的E75-HR3-FTZ-F1的级联表达。因此,LdE74是马铃薯甲虫幼虫-蛹变态及附肢生长所必需的;LdE74介导20E信号并不依赖经典的E75-HR3-FTZ-F1级联信号转导。5.Taiman和HR4参与变态前清肠的机理在多种昆虫中,漫游期幼虫停止取食,在化蛹前排空肠道。在本章中,我们发现干扰LdTai和LdHR4的四龄（末龄）幼虫不能正常完成化蛹前的清肠。处理后的幼虫肠道充满食物,并且有显著的黑化现象。由于LdTai正调控LdHR4,本章仅研究LdHR4调控清肠的机理。比较研究结果表明,干扰LdHR3影响幼虫到蛹的变态,但是不影响清肠;共同干扰LdHR4和LdHR3,影响变态和清肠。干扰LdHR4下调中肠LdUAP2的表达量,降低中肠几丁质含量,破坏围食膜结构。干扰LdHR3则不影响中肠几丁质的含量及围食膜的结构。定量检测发现,干扰LdHR4的幼虫肠道中黑化途径相关基因超量表达,黑化作用加强。同样,在赤拟谷盗末龄中期干扰TcHR4,幼虫也不能完成清肠,前后肠均黑化。因此,20E信号转导途径EcR/USP-HR3-FTZ-F1不是启动清肠的必要条件。在马铃薯甲虫中,Taiman和HR4通过影响中肠围食膜结构的完整和肠道中食物残渣的黑化调控化蛹前的清肠。